În experimentul de acidificare (al doilea), probele fecale au fost colectate la sfârșitul perioadei de hrănire prin disecție din rect de la șase pești pe tratament dietetic și analizate individual pentru P, Ca și conținut de cenușă insolubilă în acid (AIA) pentru a determina digestibilitatea de P, Ca și substanță uscată conform metodei descrise anterior (Sugiura și Ferraris, 2004).

fosforului

Măsurători ale pH-ului

Pentru primul experiment, pH-ul stomacului, al cecului piloric, al intestinului subțire și al intestinului gros a fost măsurat la diferite perioade post-prandiale (0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 12 și 24 h) pentru a compara pH-ul GI între păstrăv curcubeu și șobolani și între două dimensiuni diferite de păstrăv curcubeu, folosind benzi indicatoare de pH cu mai multe domenii (benzi indicatoare de pH cu intervale multiple de 0,2 unități; colorpHast, EMD Chemicals, New Jersey, SUA).

În cel de-al doilea experiment, pH-ul alimentar a fost determinat făcând suspensia alimentelor cu apă distilată și folosind un electrod de pH (Orion, New York, SUA). PH-ul diferitelor secțiuni ale tractului gastrointestinal al peștilor (N = 4 pești pe dietă de testare) a fost determinat folosind benzile de pH h12 h după hrănire. După calibrarea cu electrodul de pH, benzile de pH au permis determinări rapide ale pH-ului fluidelor care aderă la suprafața țesutului, care poate fi diferit de cel al lumenului (Berne și Levy, 2000). Lucrările preliminare au arătat că pH-ul gastric se schimbă cu ± 2,0 unități de pH în funcție de timpul postprandial și să difere cu până la 3 unități de pH între șobolani și șoareci, diferențe ușor detectabile de benzi. Următoarele secțiuni GI au fost studiate pentru pH-ul fluidului luminal (chim) și al țesutului: stomac (zona corpusului); caeca pilorică; intestinul subțire piloric (imediat posterior sfincterului piloric cu multe joncțiuni cecale); intestin subțire (proximal); și intestinul gros (distal). Definițiile țesuturilor au fost descrise anterior (Sugiura și Ferraris, 2004).

Determinarea abundenței ARNm

PH-ul luminal gastric postprandial al peștilor și șobolanilor. Orele post-prandiale (axa x) sunt în scara log (0 h este valoarea pre-prandială), iar pH-ul luminal gastric (axa y) este indicat ca medie ± s.e.m. (ca bare de eroare, N = 8 pentru pești și N = 4 pentru șobolani). Peștii studiați au fost patru păstrăv curcubeu în vârstă de 2 luni (10,24 ± 0,54 g; masa corporală medie ± s.m.) și patru păstrăv curcubeu în vârstă de 15 luni (211,4 ± 2,4 g). Deoarece nu a existat nicio diferență semnificativă între acești pești mici și mijlocii, aceștia au fost grupați pentru comparație statistică cu șobolanii. Șobolanii studiați au fost patru șobolani de 1-2 luni (120,3 ± 3,2 g). Diferența dintre pești și șobolani în pH-ul luminal gastric la fiecare oră postprandială este prezentată cu asteriscuri: * P ** P 0.1).

De la 0 la 24 de ore după hrănire, pH-ul intestinal a variat de la 7,15 (media a patru pești de fiecare dată) la 8,25 la peștii mici și de la 7,38 la 8,65 la peștii de dimensiuni medii. Timpul de prelevare a probelor a fost același cu cel din Fig. 1, dar nu a existat în mod clar niciun efect al timpului asupra pH-ului intestinal și cecal (P = 0,6), indicând faptul că pH-ul luminal în aceste organe este reglat în limite strânse. PH-ul cecal a variat de la 7,03 la 7,58 la peștii mici și de la 7,10 la 7,53 la peștii de dimensiuni medii. Nu a existat nicio diferență semnificativă între peștii de dimensiuni mici și mijlocii în pH-ul intestinal și cel cecal (P = 0,1 pentru pH-ul intestinal; P = 0,7 pentru pH-ul cecal, prin testul t asociat). Cu toate acestea, atât la peștii mici, cât și la cei de dimensiuni medii, pH-ul cecal a fost semnificativ mai mic decât pH-ul intestinal (P = 0,01 pentru peștii mici; P = 0,001 pentru peștii de dimensiuni medii). La șobolani, pH-ul duodenal, jejunal și ileal au fost toate similare (P = 0,03 până la 0,9) la toate orele postprandiale. PH-ul (media a patru șobolani de fiecare dată) a variat între 7,42 și 7,95 în duoden, 7,41 până la 7,83 în jejun și 7,52 până la 7,85 în ileon. PH-ul intestinal al peștilor (intervalul 7.5-8.3) nu a diferit semnificativ (P = 0.1) de cel al șobolanilor (7.5-7.8), dar pH-ul cecal a fost semnificativ mai mic (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

PH-ul dietelor de testare și al tractului digestiv al peștilor la 12 ore postprandial

Peștii hrăniți cu o dietă conținând 3,5% H2SO4 sau 5% acid acetic, au excretat semnificativ mai puțin P în fecale (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Excrețiile fecale și digestibilitatea fosforului și calciului în dietele de test hrănite cu pești

Arborele filogenetic al gastrinei și al H +/K + -ATPazei

Eticheta de secvență exprimată asemănătoare gastrinei păstrăvului (EST) are 64% similaritate (în 117 secvențe de aminoacizi) cu gastrina halibut, 57% asemănare cu gastrina pufferfish (fugu) (Kurokawa și colab., 2003), dar doar ∼40% similaritate cu păstrăv CCKs (Fig. 2A). Păstrăvul H +/K + -ATPazat EST este 98% omolog cu ATP4A (în secvența de 257 aminoacizi), 95% omolog cu ATP4A uman, dar numai 75-78% omolog cu păstrăvul Na +/K + -ATPază izoforme (ATP1A) (Fig. 2B). Acest EST a fost raportat ca păstrăv curcubeu ATP4A (acces la GenBank: DQ103514).

Adaptări moleculare la acizi exogeni

Abundența de ARNm la starea de echilibru a genei asemănătoare gastrinei nu a variat în funcție de aportul de acid dietetic (Fig. 3A). În plus, mARN-ul gastrinei a fost distribuit în mod egal în corpus (corp) și regiunile antrale ale stomacului păstrăv. ARNm SST1 a fost abundent în antrum, dar rar în corp (fig. 3B). Acidul dietetic nu a avut niciun efect asupra expresiei SST1. Antiacidul (CaCO3) a avut tendința de a scădea abundența de ARNm SST1 în antr. Abundența de ARNm a ATP4A a fost ridicată în corpus și rară în stomacul antral (Fig. 3C). Modelul de distribuție tisulară a ATP4A a fost, prin urmare, opus celui al SST1. Acidul dietetic a scăzut abundența de ARNm ATP4A, dar CaCO3 din dietă nu a crescut abundența de ARNm ATP4A. ARNm-ul celor două izoforme SST2 a fost abundent atât în ​​corpus, cât și în stomacul antral (Fig. 3D, F), un model de distribuție diferit de cel al SST1 situat exclusiv în antrum. Exprimarea celor două izoforme SST2 a fost independentă de acidul dietetic sau antiacid în antr și în corpul stomacului. ARNm NBC a fost abundent în corpul stomacului, în timp ce aproximativ o treime din această cantitate a fost detectată și în stomacul antral (Fig. 3E). Atât în ​​corpus, cât și în stomacul antral, abundența mARN-ului NBC a scăzut la peștele alimentat cu diete acidificate. Modificările induse de acid în expresia ATP4A și NBC mARN au fost puternic corelate una cu cealaltă; y = 0.784x + 0.520, R 2 = 0.708 (Fig. 4).

Rudenie filogenică a păstrăvului gastrin-like EST (A) și păstrăv ATP4A-like EST (B) cu cele ale altor specii. Pe baza secvenței de aminoacizi traduse, păstrăvul gastrin-like EST are 64% omologie cu halibut gastrin, iar păstrăvul ATP4A-like EST este 98% omolog cu ATP4A plătit. Gastrina și CCK aparțin aceleiași familii de peptide, dar ESTul păstrăvului, asemănător gastrinei, aparține unui grup de gastrină care este suficient îndepărtat din grupul CCK de păstrăv (nu este prezentat). Gaz, gastrină; CCK: colecistochinină; ATP4A: H +/K + -ATPaza; ATP1A: Na +/K + -ATPaza. Păstrăvul EST1 (gi: 42752688) și păstrăvul EST2 (gi: 42817423) în B sunt 97% omoloage unul cu celălalt în secvența de bază nucleotidică.

Efectele diferiților acizi dietetici (axa x) asupra expresiei genei relative (axa y) în regiunile antrale și corpus (corp) ale stomacului păstrăvului curcubeu. Unul dintre următorii acizi sau antiacizi a fost adăugat la dieta bazală (Fără acid) (g/g). HCI: 12 mol 1 -1 HCI 5,0%; H2SO4h, 18 mol l -1 H2SO4 3,5%; H2SO4L: 18 mol l -1 H2SO4 1,0%; acetic: acid acetic glacial 5,0%; antiacid: CaCO3 5,0%. Fără acid: dieta bazală (vezi Tabelul 1). Barele gri reprezintă date despre corpul stomacului; bare albe reprezintă date ale stomacului antral. Fiecare coloană reprezintă media (+ s.m. ca bară de eroare) a patru pești. Coloanele din fiecare regiune a stomacului etichetate cu litere diferite sunt semnificativ diferite (P +/K + -ATPase; SST, somatostatină; NBC, Na +/cotransportator bicarbonat). Diferențele de abundență de ARNm între stomacul antral și corpus (toate tratamentele incluse) au fost după cum urmează: gena asemănătoare gastrinei (P = 0,8); ATP4A (P = 0,0003); SST1 (P = 0,02); SST2 (P = 0,002); SST2-2 (P = 0,8); NBC (P = 0,0007).

Activitatea de hrănire și digestibilitatea P

Deși acizii organici din dietă îmbunătățesc digestia P în alimentele pentru pești (Vielma și colab., 1999), acizii anorganici sunt mult mai puțin costisitori și, prin urmare, sunt soluția preferată pentru problema din industria hranei a digestibilității scăzute a P în dietele de pește. Cu toate acestea, acizii anorganici pot deprima consumul de alimente, așa cum sa observat în acest studiu și în studiile anterioare. La porci, utilizarea acizilor anorganici ca suplimente alimentare nu a avut succes, deoarece acizii au scăzut grav aportul de furaje (Ravindran și Kornegay, 1993). Cu toate acestea, la găini, H2SO4 nu pare să reducă aportul de hrană la 1,2% (greutate/greutate), dar a redus semnificativ aportul de 2,4% sau mai mare (Capdevielle și colab., 1996; Pritzl și Kienholz, 1973). PH-ul dietei de 2,4% a fost redus la 3,6. Puii au fost, de asemenea, toleranți la HCl dietetic până la 0,12 mol HCl kg -1 furaj (∼1,18% g/g acid clorhidric per furaj), dar la 0,24 mol kg -1 furaj, care a scăzut pH-ul alimentar la 4,6, depresie de creștere și furaj conversia a devenit semnificativă (Pritzl și Kienholz, 1973). La șobolani, toleranța de hrănire la acidificarea dietei pare a fi mult mai mare; adică până la 0,6 mol HCl kg -1 furaj (± 5,2% acid clorhidric) cu pH alimentar de 2,84 pare să nu cauzeze o reducere detectabilă a aportului de furaje (L'Estrange și Upton, 1976).

La pești, un studiu preliminar (nepublicat) a indicat faptul că dieta acidificatoare pe bază de făină de pește cu acid sulfuric (3,75%) a crescut digestibilitatea P cu 25%, astfel încât excreția de fecal P a scăzut semnificativ. Peștele a consumat rapid dieta acidificată (pH 2,4) timp de 23 de zile de hrănire, cu doar o ușoară reducere a aportului de hrană. Cu toate acestea, în studiul anterior s-au folosit diete umede, în timp ce în studiul de față s-au folosit diete uscate.

Acizii dietetici și antiacidul nu au modificat dramatic pH-ul conținutului GI la nicio secțiune, sugerând că păstrăvul reglează secreția endogenă de acid și/sau bicarbonat pentru a evita abaterile marcate de la pH-ul intestinal normal. Suplimentarea cu HCl a crescut digestibilitatea P doar modest, probabil pentru că ar fi putut reduce secreția de acid endogen prin inhibarea directă a expresiei mARN-ului ATP4A și a abundenței pompei de protoni. Alți acizi nu scad semnificativ nivelurile de ARNm de ATP4A și, prin urmare, pot fi mai eficiente decât HCI în creșterea digestibilității P.

Corelația dintre ATP4A (H +/K + -ATPase, pompa de protoni) și NBC (Na +/cotransportor bicarbonat) abundența mARN în stomacul antral și corpus al păstrăvului curcubeu. Fiecare punct reprezintă un eșantion. Un eșantion antral și un corpus au fost colectate de la fiecare pește. În antrum (diamante deschise), ARNm ATP4A este aproape absent, în timp ce cantități mici de ARNm NBC sunt prezente. În corpus (diamante umplute), atât ARNm ATP4A cât și ARNm NBC sunt abundente și abundențele lor sunt corelate între ele (regresia corpului ATP4A la corpus NBC: y = 0,86x + 0,36; R 2 = 0,40). Unitățile axelor x și y sunt relative (media tuturor punctelor de date este 1).

Acidificarea alimentară crește digestibilitatea fosforului (A), dar scade expresia ARNm H +/K + -ATPază (B) la păstrăvul curcubeu. Fiecare punct reprezintă media (± s.m.) a șase pești pentru măsurători de digestibilitate a fosforului și patru pești pentru măsurători de ARNm H +/K + -ATPază. Legenda arată tratamente dietetice (acizi utilizați). Semnificația acidificării dietetice asupra digestibilității fosforului (expresia ARNm P +/K + -ATPază (P +/K + -ATPază) (cunoscută și sub numele de pompă de protoni sau ATP4A/B) situată în tubulovesiculele citoplasmatice și canaliculii secretori apicali ai celulelor parietale. numărul de pompe de protoni din membrana apicală a celulelor parietale este foarte reglementat și se modifică semnificativ în timpul unei singure mese (Samuelson și Hinkle, 2003). Cu toate acestea, poate exista o reglare pe termen lung a nivelului de bază al pompelor de protoni în celulele parietale și acest tip de reglare ar trebui să se distingă de binecunoscuta reglare acută a secreției acide în timpul meselor. Deoarece țesuturile au fost colectate de pești înfometați peste noapte, constatările noastre reflectă adaptări cronice la acidificare și nu sunt confundate de diferențele observate în activitatea de hrănire.

Scăderea abundenței de ARNm ATP4A în stare de echilibru indusă de acidificarea dietetică cronică sugerează că sinteza păstrăvului ATP4A ar putea fi inhibată prin creșteri pe termen lung ale concentrației produsului său, H + luminal. Consumul de inhibitor al H +/K + -ATPazei omeprazol timp de 3 zile reduce aciditatea gastrică, dar crește rata de transcripție și abundența ARNm de șobolan H +/K + -ATPaza (Tari și colab., 1991). Exprimarea și activitatea transportorului înrudit Na +/K + -ATPaza în branhii și rinichi ale speciilor acvatice pare a fi, de asemenea, reglementate de substratul său Na + din mediu (Furriel și colab., 2000; Lin și colab., 2004).

Nu este clar de ce antiacidul alimentar (CaCO3) nu a crescut abundența mARN-ului ATP4A de păstrăv, deoarece modifică și concentrațiile de H +. La șobolanii hipergastrinemici, aportul cronic de antiacide [Al (OH) 3 și Mg (OH) 2], din motive necunoscute, pare să reducă numărul de celule parietale (Koop și colab., 1988). Acidul gastric și postul scad semnificativ abundența de ARNm gastrin la șobolani și oameni (Dockray și colab., 1993; Sandvik și colab., 1993). Dimpotrivă, realimentarea șobolanilor la post crește dramatic gastrina și scade abundența de ARNm SST în intervalul de 0,25 până la 1 oră (Wu și colab., 1991). Aceste observații la mamifere indică faptul că abundența gastrinei și ARNm SST este reglată ca răspuns la modificările acute ale acidității gastrice sau la hrănire. În studiul de față, am examinat abundența de ARNm la starea de echilibru (sau neefectuată), care ar putea fi unul dintre motivele pentru care nivelurile de ARNm de tip gastrin, SST1, SST2 ′ și SST2 ″ nu s-au modificat.

Filogenia gastrinei păstrăvului și a H +/K + -ATPazei

Gastrin

Nu există o secvență de gastrină disponibilă pentru păstrăv, dar o secvență asemănătoare gastrinei este prezentă într-o bază de date EST a păstrăvilor. Rezultatul nostru arată că ARNm a fost la fel de abundent atât în ​​stomacul antral, cât și în corp, ceea ce contrastează cu distribuția celulelor G secretoare de gastrină la mamifere. Analiza comparativă a secvenței, totuși, relevă faptul că acest EST de păstrăv, asemănător gastrinei, este cel mai strâns legat de secvențele de gastrină cunoscute ale celor doi teleosti, halibut și pufferfish. Omologia cu păstrăv CCK este mult mai mică. Gastrina teleosteană este mai strâns legată de gastrina mamiferelor și de CCK teleosteană decât gastrina reptiliană, amfibiană, aviară sau elasmobranhică.

H +/K + -ATPază

Cea mai timpurie apariție filogenetică a secreției de acid gastric apare la peștii cartilaginoși. În ciuda distanței filogenetice considerabile, un anticorp C-terminal împotriva pompei de protoni de porc ATP4A a prezentat o imunoreactivitate puternică împotriva celulelor oxinticopeptice din raia Atlanticului, sugerând asemănări structurale în ATP4A între peștii cartilaginoși primitivi și mamifere (Smolka și colab., 1994). Informațiile secvenței ATP4A descrise mai jos susțin această constatare histochimică. Nu există o secvență ATP4A disponibilă pentru păstrăv, dar a fost identificată o EST asemănătoare ATP4A, iar distribuția sa unică în stomac a fost verificată ca fiind similară cu cea a altor specii. Mai mult, abundența de ARNm a acestui EST de tip ATP4A a fost reglată în jos de acid exogen (dietetic). Întrucât rudenia filogenetică cu alte ATP4A de la diferite specii a fost foarte mare, acest EST reprezintă cel mai probabil secvența pompei de protoni de păstrăv. Secvențele ATP4A sau H +/K + -ATPase aparțineau în mod clar unui grup semnificativ diferit de grupul ATP1A sau Na +/K + -ATPase. Pentru această proteină, omologia pare să scadă, așa cum ar fi de așteptat odată cu creșterea distanței filogenetice, deoarece păstrăvul ATP4 a fost mai strâns legat de cel al fletului, urmat de amfibieni și apoi de mamifere ATP4.

Considerații practice și perspective

Majoritatea speciilor de pești, inclusiv păstrăvul curcubeu, au doar o capacitate limitată (~ 10-80%) de a digera P în făină de pește (Cho și Bureau, 2001), în timp ce păsările și mamiferele pot digera aproape 100% din P în făină de pește (Soares, Jr, 1995). P eliminat din instalațiile de acvacultură este un poluant major în mediile de apă dulce. Îmbunătățirea digestibilității P în hrana pentru pești poate reduce poluarea mediului. Mecanismul care stă la baza problemei digestibilității P a fost presupus și este confirmat acum ca fiind aciditatea slabă a stomacului de pește; prin urmare, acidificarea alimentară a fost considerată a depăși această limitare. Cu toate acestea, am arătat acum că utilizarea acizilor anorganici exogeni inhibă expresia H +/K + -ATPază și poate reduce secreția de acid endogen. Cu siguranță, efectele acute ale acidificării dietetice trebuie deosebite de efectele cronice. De asemenea, trebuie efectuate studii suplimentare la nivel proteic și funcțional pentru a confirma că consumul de acizi exogeni duce la scăderi ale secreției acide. Utilizarea acizilor organici din dietă poate oferi o soluție alternativă la această problemă importantă din industrie.

Studiile viitoare imunolocalizând H +/K + -ATPaza și determinând densitatea acesteia pe celulă oxinticopeptică sau numărul de celule oxinticopeptice per stomac ar trebui să ofere mecanisme detaliate care stau la baza acidității gastrice scăzute a stomacului păstrăv. Poate că această limitare fiziologică, împreună cu temperaturi mai scăzute ale corpului, contribuie la digestia lentă a alimentelor din pești.

MULȚUMIRI

Dorim să mulțumim personalului stației de cultură a peștilor Ed Weed, Departamentul pentru pești și animale sălbatice din Vermont, pentru ajutorul acordat în menținerea peștilor experimentali utilizați în experimentul de acidificare. De asemenea, ne exprimăm recunoștința față de dl Jeff Matthews de la New Jersey Division of Fish and Wildlife, Pequest Trout Hatchery și Natural Resource Ed. Center, Oxford, NJ, pentru donarea păstrăvului curcubeu utilizat în lucrarea comparativă. Acest proiect a fost susținut de numerele de subvenții USDA/NRI: 2004-35206-14154 și 2003-35102-13520, precum și de subvenția NSF nr. IBN-0235011.