1 Institutul de TCM și produse naturale, Școala de științe farmaceutice, Universitatea Wuhan, Wuhan 430071, China

galic

2 Laborator cheie MOE de biosinteză combinatorie și descoperire de medicamente, Universitatea Wuhan, Wuhan 430072, China

Abstract

Dimetilnitrosamina (DMN) este o hepatotoxină puternică, cancerigenă și mutagenă. În studiul nostru anterior, un acid galic candidat (GA) care există pe scară largă în alimente și fructe a fost selectat pentru capacitatea sa de a atenua toxicitatea DMN in vivo. Ne-am propus să investigăm potențialul terapeutic al GA împotriva fibrozei hepatice indusă de DMN. În primele patru săptămâni, DMN a fost administrat șobolanilor prin injecție intraperitoneală la fiecare două zile, cu excepția grupului de control. GA sau silimarina a fost administrată șobolanilor prin gavaj o dată pe zi, din a doua până la a șasea săptămână. GA a redus semnificativ afectarea ficatului în parametrii serici și a îmbunătățit capacitatea antioxidantă în țesuturile hepatice și renale. Citokinele implicate în fibroza hepatică au fost măsurate la niveluri transcripționale și translaționale. Aceste rezultate indică faptul că GA prezintă efecte antioxidante și antifibroze puternice și poate fi un medicament natural candidat eficient pentru tratamentul fibrozei hepatice.

1. Introducere

Într-un studiu anterior, am realizat că fracția de acetat de etil (EF) din fructul Terminalia bellirica are efect antifibrotic in vitro [12]. Analiza spectrometriei de masă arată că principalele componente ale EF sunt acidul galic (GA) și acidul elagic (date nepublicate). GA, un tip de acid fenolic cu efect antioxidant puternic, se găsește în dudul alb, roșu și negru, murul, zmeura, căpșuna, fructele dragonului, guava, mangostanul, papaya, frunzele de ceai și alte plante [13-15] . Deoarece GA este o componentă majoră a EF, presupunem că GA este un factor major al efectelor antifibrotice ale EF.

În acest studiu, ne propunem să dovedim că GA are capacitatea de a inversa fibroza hepatică utilizând un model animal de fibroză hepatică indusă de DMN și de a investiga biomarkerii modificați prin tratamentul GA după ce ficatul războiului suferă leziuni subcronice.

2. Materiale și metode

2.1. Produse chimice

Toți reactivii chimici și kiturile comerciale utilizate sunt menționați în tabelul suplimentar 1.

2.2. Animale

Un total de 48 de șobolani Sprague Dawley masculi (180-200 g) au fost achiziționați de la Centrul pentru animale de laborator al Universității Wuhan (Wuhan, China). Au fost adăpostiți într-un ciclu de lumină - întuneric de 12 ore la 25 ± 2 ° C și la o umiditate relativă de 50% -70%. Animalele au fost hrănite ad libitum cu o dietă standard de pelete și apă. Animalelor li s-a permis să se acomodeze cu condițiile de adăpostire timp de trei zile înainte de experimentare. Acest studiu a asigurat aprobarea de către Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) de la Centrul pentru Experimentarea Animalelor, Universitatea Wuhan, China.

2.3. Design de studiu

Șobolanii au fost împărțiți în șase grupe formate din opt animale pe grup și au fost supuși șase săptămâni de tratament. Proiectarea lucrării pe animale se referă la Su și colab. [16] și ușor modificat. Schema pentru inducerea DMN a fibrozei hepatice și pentru tratamentul GA se referă la Figura 1. Grupul I a fost administrat 0,9% soluție salină ca martor; Grupului II i s-a administrat 3 mg/kg și 7 mg/kg DMN dizolvat în soluție salină 0,9%; Grupul III a fost grupul de control pozitiv și a administrat silimarină, 100 mg/kg BW; Grupul IV a fost grupul cu doză mică GA administrat 25 mg/kg BW; Grupa V a fost grupul cu doză medie GA administrat 50 mg/kg BW; iar Grupul VI a fost grupul cu doză mare GA administrat 100 mg/kg BW.


2.4. Determinarea greutăților corpului și organelor

Greutățile corpului au fost înregistrate înainte ca șobolanii să fie sacrificați prin dislocarea coloanei vertebrale. După ce șobolanii au fost sacrificați, ficatul, rinichii și splina au fost extrase și cântărite imediat.

2.5. Determinarea biomarkerilor serici

La sfârșitul experimentului, toți șobolanii au fost postiti peste noapte și sacrificați a doua zi. Sângele a fost extras din inimă și coagulat. Serul a fost obținut prin centrifugare la 1000g timp de 10 min și depozitat la -20 ° C până la utilizare. Alanina aminotransferaza (ALT), aspartatul aminotransferaza (AST), fosfataza alcalină (ALP) și bilirubina totală (TB) au fost determinate de seturile comerciale conforme cu instrucțiunile producătorilor.

2.6. Evaluarea stresului oxidativ în ficat și rinichi

După ce ficatele și rinichii au fost extrase și cântărite, 10% omogenat de ficat sau țesut renal a fost preparat cu tampon fosfat de sodiu 50 mM (pH 7,4) și centrifugat la 5000 g timp de 10 minute la 4 ° C. Supernatanții au fost transferați în tuburi noi și depozitați la -80 ° C pentru experimentele ulterioare. Conținutul total de proteine ​​a fost determinat folosind metoda Bradford. Activitățile de superoxid dismutază (SOD) și catalază (CAT) și nivelurile de glutation (GSH) și malondialdehidă (MDA) au fost determinate de kituri comerciale, urmând pașii indicați în manualele kitului.

2.7. Hematoxilină - Eozină și colorarea tricromului Masson

Pentru fiecare șobolan, o bucată de țesut hepatic a fost fixată în 10% formalină timp de cel puțin 24 de ore, încorporată în parafină și tăiată în 5 μsecțiuni groase de m folosind un microtom rotativ. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină - eozină și colorant tricrom Masson, iar apoi lamele au fost observate la microscop (IX51, Olympus, Japonia) pentru a detecta modificările histopatologice ale ficatului.

2.8. ELISA

Supernatanții obținuți din omogenate hepatice 10% au fost diluați în concentrații adecvate pentru fiecare trusă ELISA în conformitate cu intervalul determinat din curba standard. Factorul de creștere beta 1 transformant (TGF-β1), factorul de creștere epidermică (EGF) și hidroxiprolina au fost cuantificate prin setul de testare corespunzător, în concordanță cu instrucțiunile producătorilor.

2.9. Extracția ARN și reacția în lanț a polimerazei în timp real

După ce șobolanii au fost sacrificați, ficatul a fost extras rapid și o bucată mică a fost măcinată în azot lichid. După măcinarea în azot lichid cu instrumentare fără RNază, reactivul TRIzol a fost adăugat rapid la probele de sol. PCR în timp real a fost efectuată ulterior pentru a detecta expresia genică a actinei alfa a mușchiului neted (α-SMA), receptorul factorului de creștere derivat din trombocite (PDGFR), TIMP-1 și inhibitor tisular al metaloproteinazelor 2 (TIMP-2) în triplicat utilizând sistemul de detectare în timp real PCX CFX384 Touch (Bio-Rad, China). Toate datele de cuantificare a ARNm au fost normalizate la gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază (GAPDH). Pentru primeri, consultați tabelul suplimentar 2. Pentru starea de amplificare a PCR, consultați Chen și colab. [12].

2.10. Western Blot

Concentrațiile de proteine ​​ale supernatanților din omogenat de 10% au fost determinate prin metoda Bradford. O cantitate egală de proteină din supernatant din fiecare probă a fost fracționată prin electroforeză în grad de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă cu gradient. 5% gel de stivuire și 12% gel de separare au fost folosite pentru colagen I și 5% gel de stivuire și 15% gel de separare au fost utilizate pentru Smad2, Smad3, p-Smad2, p-Smad3 și β-proteina actina. Proteinele separate au fost apoi transferate în membranele de șters cu difluorură de poliviniliden (PVDF). Legarea nespecifică a fost blocată de 5% lapte degresat sau 5% albumină serică bovină (BSA) în TBST timp de 2 ore și apoi incubată peste noapte la 4 ° C cu respectivii anticorpi primari. Membranele au fost apoi spălate și incubate cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean timp de 1 oră la temperatura camerei. Benzile imunoreactive au fost vizualizate utilizând un reactiv chemiluminescent și apoi expuse la filmul X-Omat Blue XB-1 (Kodak, Rochester, NY) pentru autoradiografie. Densitatea de gri a fiecărei pete a fost analizată prin software-ul ImageJ (NIH, Bethesda, MD, SUA).

2.11. Analize statistice
3.2. Efectul GA asupra determinării biomarkerului seric

După tratamentul cu GA timp de șase săptămâni, nivelurile serice de ALT, TB, ALP și AST au crescut cu 1,4, 1,5, 1,6 și respectiv 1,7 ori, comparativ cu martorul (Figurile 2 (b), 2 (d )), 2 (c) și 2 (a)). Tratamentul GA cu 50 sau 100 mg/kg BW a împiedicat în mod semnificativ creșterea acestor biomarkeri (p
(A)
(b)
(c)
(d)

p p p
(A)
(b)
(c)
(d)

Am folosit colorarea Masson trichrome care conține trei coloranți selectiv pentru a colora mușchii, fibrele de colagen, fibrina și eritrocitele. Din Figura 5, putem vedea că petele negre reprezintă nuclee, petele roșii reprezintă citoplasma, mușchii, eritrocitele, iar petele albastre reprezintă colagenul. Colorarea cu tricrom Masson a arătat că majoritatea septurilor fibroase s-au format în grupul DMN (Figura 5 (b)). Fibroza de punte a format un interval larg (săgeată neagră) care separă parenchimul hepatic. Tratamentele GA au inversat această observație într-un mod dependent de doză (Figurile 5 (d) –5 (f)). Doza mare de GA a fost mai eficientă în protejarea ficatului de deteriorarea DMN (Figura 5 (f)) comparativ cu tratamentul cu GA cu doză mică sau medie (Figurile 5 (d) și 5 (e)). Grupul tratat cu silimarină a prezentat septuri fibroase restrânse și reduse (Figura 5 (c)), dar numărul septelor fibroase a rămas mult mai mare decât cel din grupul tratat cu GA cu doză medie sau mare. Prin urmare, efectul fibrozei hepatice care inversează silimarina a fost mai mic decât GA la aceeași doză.

3.5. Efectele GA asupra expresiei factorului de creștere

Comparativ cu grupul de control, tratamentul cu DMN a indus o semnificativă (p
(A)
(b)
(c)

- Expresia genelor SMA, PDGFR, TIMP-1 și TIMP-2

Comparativ cu grupul de control, modelarea DMN în mod semnificativ (p
(A)
(b)
(c)
(d)

Implicațiile acestei leziuni asupra unui organ precum ficatul sunt extreme, deoarece aceste leziuni pot împiedica capacitatea țesutului de a detoxifica corpul, ducând la deteriorări în continuare exacerbate de toxinele DMN și ducând la boli metabolice, cum ar fi fibroza hepatică. Creșterea numărului de septuri fibroase prin tratament DMN a fost confirmată prin colorarea cu tricrom Masson. Colectiv, aceste septuri fibroase indică o stare masivă de fibroză care apare ca răspuns la expunerea la DMN. Cu toate acestea, acest fenomen necesită cel puțin un tratament cu GA cu doză medie, deoarece tratamentul cu GA cu doză mică nu a prezentat diferențe semnificative în comparație cu grupul tratat cu DMN.


5. Concluzie

Prezentul studiu oferă primele dovezi că GA poate reduce fibroza hepatică indusă de DMN la șobolani bazându-se pe capacitatea sa antioxidantă superioară și să ia parte la reglarea expresiei citokinelor. Mai mult, acest studiu oferă o strategie alternativă atractivă împotriva fibrozei hepatice, deoarece GA există pe scară largă în plante și alimente.

Disponibilitatea datelor

Datele utilizate pentru a susține concluziile acestui studiu sunt disponibile de la autorul relevant, la cerere.

Conflicte de interes

Autorii declară că nu există conflicte de interese.

Mulțumiri

Mulțumim Jane Hannah Kim de la Departamentul de Biologie Moleculară, Celulară și de Sisteme, Universitatea din California, Riverside, SUA, pentru editarea limbajului acestui articol. Această lucrare a fost susținută de Proiectul Programului Național de Cercetare de Doisprezece-Cinci Ani din China (2012BAI29B03), Fondul Commonweal de Cercetare Specializată al Agriculturii din China (201103016) și planul Nanjing 321 pentru aducerea talentelor tehnologice de vârf (2013A12011).

Materiale suplimentare

Tabelul S1. Lista producătorilor de reactivi și produse chimice. Tabelul S2. Primere PCR în timp real pentru analiză. (Materiale suplimentare)

Referințe