1 Departamentul de Cardiologie, Primul Spital Afiliat al Anhui Medical University, Anhui 230022, China
2 Departamentul de hematologie, al doilea spital afiliat al Anhui Medical University, Anhui 230601, China
3 Laborator de biologie moleculară, Anhui Medical University, Anhui 230032, China
Abstract
fundal. Toate-trans-acidul retinoic (atRA) este eficient pentru multe boli proliferative. Am investigat efectele protectoare ale atRA împotriva aterosclerozei. Metode. Iepurii au fost alocați aleatoriu pentru a primi o dietă bazală sau un HFD timp de 4 săptămâni. Grupul HFD a primit apoi rosuvastatină (3 mg/zi), atRA (5 mg/kg/zi), respectiv același volum de vehicul, pentru următoarele 8 săptămâni. Rezultate. Grupul HFD a prezentat creșteri ale lipidelor plasmatice și ale formării plăcii aortice. Expresia P-selectinei și legarea fibrinogenului pe trombocite sau depunerea pe intima aortei au crescut semnificativ, la fel ca și nivelurile de TNF-α, IL-6 și fibrinogen în plasmă. După 8 săptămâni de tratament cu atRA, a existat o scădere semnificativă a lipidelor plasmatice și îmbunătățirea leziunilor aortice. AtRA a inhibat, de asemenea, expresia legării P-selectinei și fibrinogenului pe trombocite și a depunerii pe intima aortei. Concluzie. AtRA poate ameliora AS indusă de HFD la iepuri prin inhibarea activării și inflamației plachetelor.
1. Introducere
Toate-trans-acidul retinoic (atRA) este o familie de molecule de semnalizare care sunt legate chimic de vitamina A (retinol). AtRA are efecte in vitro puternice asupra unui număr de procese implicate în leziuni și reparații vasculare, cum ar fi modularea proliferării celulelor musculare netede (SMC) și inducerea diferențierii SMC [1-4]. Recent, s-a demonstrat că atRA limitează restenoza după angioplastia cu balon la un model de iepure [5], precum și efecte favorabile în reducerea masei neointimale și provocarea remodelării geometrice în artera carotidă a șobolanului rănit [6]. Cu toate acestea, până în prezent nu există rapoarte cu privire la rolul său în ateroscleroza indusă de dietă bogată în grăsimi (HFD).
Prezentul studiu a fost întreprins pentru a investiga posibilele efecte terapeutice ale atRA asupra AS indusă de HFD, cu un accent special pe potențialul său de a inhiba activarea trombocitelor, de a preveni inflamația și de a reduce lipidele sanguine și de a reduce leziunile aortice, în timp ce rosuvastatina a fost utilizată Control.
2. Metode
2.1. Proceduri pentru animale
Iepurii masculi din Noua Zeelandă (clasa obișnuită) au fost cumpărați de la o instalație experimentală pentru animale din Nanjing, China. Iepurii (
kg) au fost menținute în cuști individuale la temperaturi moderate și condiții de lumină schimbătoare (lumină de 12 ore, întuneric de 12 ore) cu acces la alimente și apă curată. După o perioadă de aclimatizare de 3 zile, iepurii au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri. Grupul de control (
) i s-a administrat o dietă bazală, în timp ce unui alt grup i s-a administrat HFD care conținea 5% untură de porc și 1% colesterol. Patru săptămâni mai târziu, animalele din grupul HFD au fost împărțite în trei grupuri și au primit fie rosuvastatină calcică (3 mg/zi), atRA (5 mg/kg/zi), fie același volum de vehicul prin administrare intragastrică timp de 8 săptămâni (
/ grup). Rosuvastatina și atRA au fost dizolvate cu apă.
La sfârșitul experimentului, iepurii au fost posti timp de 8 ore înainte de anestezie (pentobarbital 3% g/v administrat la 1 ml/kg). Sângele a fost colectat din artera carotidă comună. Iepurii au fost sacrificați, iar aortele au fost îndepărtate cu grijă și tăiate. Țesutul a fost observat și apoi plasat în 10% (greutate/volum) formalină neutră timp de 24 de ore. Procedurile experimentale pe animale au fost efectuate în conformitate cu Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor interne din cadrul Universității medicale Anhui și au respectat Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea laboratorului.
2.2. Reactivi
Rosuvastatin calciu a fost cumpărat de la AstraZeneca; atRA și ADP au fost achiziționate de la Sigma. Trombina a fost achiziționată de la Pharmaceutical Co., Ltd., Hunan. Anticorp anti-iepure CD62-P FITC conjugat a fost achiziționat de la Bioss, Beijing. Anticorpul policlonal anti-fibrinogen de pui (FITC) a fost achiziționat de la Abcam. Kituri SP-9000/9001/9002 Histostain-Plus au fost achiziționate de la ZYMED.
2.3. Colectarea sângelui și pregătirea trombocitelor
Probele de sânge au fost colectate în tuburi care conțin 3,8% citrat de sodiu (1/9 v/v) pentru măsurători biochimice și citometrie în flux. Proba de sânge a fost centrifugată la 1000 g timp de 10 minute pentru a colecta plasma. Plasma bogată în trombocite (PRP) a fost obținută prin centrifugare la 300 g timp de 10 minute. Trombocitele au fost apoi izolate din PRP folosind PBS pentru a se spăla de două ori așa cum s-a descris anterior [13, 17].
2.4. Detectarea expresiei trombocitelor P-Selectin (CD62-P) și a legării fibrinogenului prin citometrie în flux
Trombocitele de repaus și trombocitele activate de trombină (1 U/ml) sau ADP (concentrația finală este de 20 μM) au fost incubate cu CD62P anti-iepure conjugat cu FITC sau fibrinogen timp de 30 de minute la temperatura camerei în întuneric. PBS (0,5 mL) a fost adăugat la probă imediat înainte de achiziționarea datelor. Toate probele au fost analizate prin citometrie în flux prin FC500 (Beckman Coulter), utilizând 10.000 de evenimente pe probă cu dispersie de lumină și canale de fluorescență stabilite la un câștig logaritmic. Populația de trombocite a fost analizată pentru intensitatea medie a fluorescenței (IFM).
2.5. Măsurarea biochimică
Concentrațiile lipidelor plasmatice au fost determinate folosind kituri de testare a enzimei de diagnosticare. Fibrinogen plasmatic, IL-6 și TNF-α au fost măsurate utilizând un fibrinogen de iepure Quantikine, IL-6 și TNF-α set de test imunosorbent legat de enzime (ELISA) (sisteme de cercetare și dezvoltare).
2.6. Morfologie și imunohistochimie
2.7. Analize statistice
Toate analizele statistice au fost efectuate folosind programul SPSS, versiunea 13.0, pentru Windows. Toate datele sunt exprimate ca medie ± deviație standard (SD). Comparațiile între grupuri au fost efectuate folosind analiza unică a varianței (ANOVA) și metoda Student-Newman-Keuls (SNK). Valorile
au fost considerate semnificative statistic.
3. Rezultate
3.1. atRA Lipide plasmatice îmbunătățite la iepurii AS induși de HFD
Comparativ cu grupul martor, creșterea semnificativă a lipidelor plasmatice indusă de HFD, inclusiv colesterolul total (Total-C), colesterolul lipoproteic cu densitate mică (LDL-C), colesterolul cu lipoproteine cu densitate mare (HDL-C) și trigliceridele (TG) . Administrarea orală de rosuvastatină sau atRA a redus în mod semnificativ Total-C și LDL-C și ambele au crescut semnificativ HDL-C în timpul alimentării cu HFD (Tabelul 1). Aceste descoperiri sugerează că intervenția atRA poate ajuta la restabilirea dezechilibrului lipidic indus de HFD.
2 9. 3 7 ± 4. 3 6
2 4. 5 7 ± 4. 5 7
1 6. 2 7 ± 2. 4 0
1 7. 2 4 ± 4. 4 4
1 2. 9 2 ± 3. 1 9
comparativ cu grupul de control; ▲
3.2. plăci arteriale ameliorate atRA la iepuri AS induși de HFD
Caracteristicile leziunilor arteriale au fost examinate prin colorare în secțiune patologică HE folosind microscopie cu lumină. În grupul de control, pereții vasului erau rotunzi, cu grosimi uniforme. Plăcile elastice interioare și exterioare erau clare și complete. Miezul celulei endoteliale a fost colorat și aranjat uniform. Nu s-au văzut SMC sub endoteliu (Figura 1 (a)).
comparativ cu grupul de control, ▲
În grupul HFD, pereții vaselor au fost inegali și a fost prezentă o hiperplazie semnificativă a intimei. Au existat dovezi ale celulelor spumante și substanțelor necrotice, unde s-au observat cristale de colesterol și câteva celule inflamatorii. Plăcile elastice interioare au fost sparte și o proporție mare de SMC-uri cu miez în formă de fus au fost aranjate în dezordine (Figura 1 (b)). Tratamentul cu rosuvastatină și atRA a dus la obținerea unor vase de sânge mai uniforme, la o intensitate mai netedă, mai puține celule de spumă și celule inflamatorii și mai puține substanțe necrotice (Figurile 1 (c) și 1 (d)). Mai mult, am măsurat grosimea intimă aortică și grosimea maximă a peretelui vasului în acest studiu. Am observat că alimentarea cu HFD a dus la creșteri transparente fie a grosimii intime aortice, cât și a grosimii maxime a peretelui vasului, care au fost semnificativ reduse fie în grupurile tratate cu atRA, fie cu rosuvastatină (Figurile 1 (e) și 1 (f)).
3.3. Expresia inhibată atRA a CD62-P și legarea fibrinogenului în trombocite
Activarea trombocitelor a fost investigată prin verificarea expresiei CD62-P a trombocitelor și legarea fibrinogenului prin citometrie în flux. Așa cum se arată în Figurile 2 și 3, procentul și MFI de fibrinogen și CD62-P au fost semnificativ mai mici în trombocitele în repaus din toate grupurile, comparativ cu rezultatele din trombină și trombocite stimulate de ADP. Trombocitele din grupul martor (fie în stare de repaus, fie în stare activată) au avut o expresie mai mică a fibrinogenului și a CD62-P comparativ cu cea observată în grupurile HFD, rosuvastatină și atRA. Cu toate acestea, în comparație cu grupul HFD, trombocitele din grupurile de rosuvastatină și atRA au avut o expresie semnificativ mai scăzută a fibrinogenului și CD62-P pe suprafețele trombocitelor, sugerând că atRA a suprimat activarea trombocitelor.
comparativ cu grupul de control, ▲
comparativ cu grupul de control, ▲
3.4. atRA Depunerea reprimată a fibrinogenului și expresia CD62-P pe artere
Așa cum se arată în Figurile 4 (a) și respectiv 5 (a), un nivel foarte scăzut de depunere a fibrinogenului și expresia CD62-P a fost găsit în intima din grupul de control, în comparație cu cel din grupul HFD (Figurile 4 ( b) și 5 (b)). Dar tratamentul cu rosuvastatină sau atRA a dus la îmbunătățiri în depunerea fibrinogenului și exprimarea CD62-P în intimele arterelor (Figurile 4 (c) și 4 (d)) și (Figurile 5 (c) și 5 (d)). Leziunile din grupul HFD conțineau o acumulare extinsă de celule de spumă care nu a fost evidentă în grupul de tratament cu atRA. Prezența leziunilor semnificativ mai mari în grupul HFD decât grupul martor a sugerat că fibrinogenul și CD62-P pot juca un rol în creșterea leziunilor aterosclerotice.
3.5. atRA Niveluri scăzute de citokine inflamatorii și fibrinogen în plasmă
Pe lângă IL-6 și TNF-α, fibrinogenul plasmatic este, de asemenea, un marker important al inflamației [20]. Nivelurile de fibrinogen, TNF-α, și IL-6 au fost semnificativ mai mari în grupul HFD decât în grupul martor (Tabelul 2), în timp ce au fost semnificativ reduse atât prin tratamentul cu rosuvastatină, cât și prin tratamentul cu atRA. Mai mult, efectul a fost mult mai marcat numeric cu atRA decât cu rosuvastatină.
7 9. 5 4 ± 1 2. 5 3
3 8. 7 6 ± 6. 3 6
1 4 2. 1 2 ± 1 4. 5 7
6 2. 0 4 ± 6. 3 9
1 0 1. 8 8 ± 1 6. 7 8
4 9. 9 7 ± 7. 3 2
4 3. 8 2 ± 5. 7 1
comparativ cu grupul de control; ▲
4. Discutie
AtRA este un metabolit activ al vitaminei A care inhibă migrația celulară, reglează coagularea extrinsecă și promovează diferențierea celulară [1-3, 21, 22]. Deși studiile anterioare s-au concentrat asupra efectelor sale antitumorale [21-23], s-a demonstrat că atRA limitează restenoza după angioplastia cu balon la un model de iepure [5], sugerând rolul său potențial în alte modele AS. În studiul actual, am constatat că administrarea orală a atRA a îmbunătățit caracteristicile AS și a redus expresiile P-selectinei și fibrinogenului și a concentrațiilor de citokine inflamatorii la iepuri AS induse de HFD. Rosuvastatina, un medicament clasic pentru scăderea lipidelor de statine în clinică [10, 24], a fost utilizat ca control pozitiv și s-a găsit un efect comparabil între atRA - și rosuvastatină- iepurii tratați în studiul actual.
Etapa inițială a AS implică aderența monocitelor la suprafața endoteliului rănit, proces facilitat de moleculele de aderență [7]. Apoi, trombocitele activate determină eliberarea corpului Weibel-Palade care duce la rularea leucocitelor mediată de CD62-P, sugerând că CD62-P trombocitară promovează dezvoltarea inflamației și deteriorarea AS [25-27]. Pe de altă parte, depunerea de fibrinogen stimulează secreția de chemokine și facilitează o interacțiune neutrofil-endotelială în șocul septic [16, 28]. Am arătat anterior că fibrinogenul îmbunătățește nivelul CD62-P intracelular al trombocitelor și afectează expresia CD62-P pe suprafața trombocitelor [13, 17, 27, 29]. Aceste descoperiri susțin un rol al fibrinogenului în AS și sugerează că CD62-P poate contribui la formarea AS.
Deși atât tratamentele cu rosuvastatină, cât și cele cu atRA au dus la ameliorarea eficientă a AS la iepuri, s-a putut găsi o îmbunătățire mult mai mare în grupul atRA decât iepurii tratați cu rosuvastatină, incluzând mai puține plăci aortice, o inhibare mai mare a depunerii fibrinogenului și expresia selectivului P pe trombocite. . și intima aortei. Mai mult, am constatat că efectul de scădere a lipidelor dintre rosuvastatină și atRA a arătat o mică diferență, de exemplu, măsurile de scădere a LDL-C și creșterea HDL-C au fost mai mari în grupul cu rosuvastatină decât atRA. Aceste descoperiri sugerează că atRA ar putea reduce formarea de AS printr-un mecanism diferit de rosuvastatină. O posibilitate este ca atRA să inhibe proliferarea celulară indusă de PDGF și să inducă apoptoza în SMC-urile aortice [1-3]. În al doilea rând, o posibilitate mai importantă este că atRA ar putea preveni dezvoltarea AS prin inhibarea mai mare a expresiei CD62-P și a secreției de fibrinogen, pe lângă efectul său de scădere a lipidelor, deoarece s-a demonstrat că P-selectina este un tratament terapeutic. țintă pentru AS [30].
Studiile clinice și experimentale susțin ideea că inflamația cronică joacă un rol major în dezvoltarea AS [11]. În studiul nostru, s-a demonstrat că rosuvastatina și atRA contracarează creșterea citokinelor inflamatorii, cum ar fi IL-6 și TNF.-α rezultat din HFD. Aceste constatări sunt în acord cu studiile anterioare [31, 32] care evidențiază rolul proprietăților antiinflamatorii ale rosuvastatinei în prevenirea dezvoltării AS, inclusiv inhibarea aderenței celulelor endoteliale și aderența monocitelor, reducerea activării plasminogenului tisular și suprimarea TNF-α și MCP-1 în peretele vasului [33-35]. Fibrinogenul nu este implicat doar în dezvoltarea bolilor cardiovasculare, ci este și un marker inflamator [20]. Inhibarea fibrinogenului și citokinelor inflamatorii de către atRA subliniază efectul antiinflamator de către atRA în modelul AS [36]. Cu toate acestea, s-a propus, de asemenea, că atRA poate crește formarea celulelor de spumă și leziunile aterosclerotice prin reglarea ascendentă a CD36 și MCP-1 in vitro [37], sugerând că funcțiile biologice ale atRA în AS sunt incluzive, care necesită investigații suplimentare.
Luate împreună, rezultatele prezentului studiu justifică investigarea ulterioară a atRA ca agent potențial pentru prevenirea și tratarea SA și restenoza. Deoarece transducția semnalului subiacent și mecanismele care duc la inhibarea expresiei fibrinogenului și CD62-P de către atRA rămân a fi elucidate, ar trebui efectuate studii suplimentare pentru a investiga mecanismele subiacente de inhibare a fibrinogenului și a exprimării CD62-P de către atRA, de asemenea ca doză optimă și cale de administrare, astfel încât efectele sale de protecție să poată fi maximizate și efectele secundare să fie reduse.
Conflict de interese
Autorii declară că nu există conflicte de interese.
Mulțumiri
Acest studiu a fost susținut de granturile de la Fundația Națională de Științe Naturale din China (nr. 30971226), Fondul de doctorat al Ministerului Educației din China (20103420110001), Proiectul cheie intercolegială de știință a naturii din provincia Anhui (nr. KJ2011A158), Fundația pentru Științe Naturale din provincia Anhui (nr. 090413269X) și Programul de cercetare pentru tineret al Departamentului provincial de sănătate din Anhui (nr. 09B106). Autorii doresc să-i mulțumească Dr. Heyu Ni pentru sfaturile sale din timpul experimentelor.
Referințe
- Mănâncăm prea multe alimente bogate în acid oxalic Întrebați dr
- Rezumat Receptorul reninei P188 (Pro) (PRR) mediază hipertensiunea arterială indusă de dietă bogată în grăsimi
- Acidul aminobutiric atenuează insuficiența oxidativă cerebrală indusă de dietă bogată în grăsimi prin îmbunătățire
- A9 EXPUNEREA PE TERMEN SCURT LA O DIETĂ RIDICĂ A ZAHARULUI REDUC PRODUCȚIA ACIDULUI GRAS AL LANTULUI SCURT ȘI CREȘTE
- Baicalin atenuează obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi și disfuncția hepatică Răspunsul la doză și potențialul