Contribuit de Chad A. Mirkin, 25 martie 2015 (trimis spre examinare 13 februarie 2015; revizuit de Dean Ho și Wei Li)

nucleici

Semnificaţie

Pacienții diabetici suferă adesea de vindecarea rănilor afectată, care se poate transforma în ulcere diabetice care nu vindecă, facilitează infecțiile bacteriene și necesită amputarea. Strategiile actuale pentru tratament nu au reușit să atingă eficacitatea anticipată și nu abordează anomaliile moleculare fundamentale care împiedică închiderea eficientă a plăgii. În această lucrare, introducem o abordare neidentificată anterior pentru tratarea vindecării rănilor diabetice prin utilizarea acizilor nucleici sferici administrați local pentru a efectua eliminarea acidului gangliozidic-monosialic 3 (GM3) sintază, un mediator al vindecării rănilor afectate, la șoarecii diabetici de tip 2 Pe lângă punerea bazelor pentru dezvoltarea unei terapii pentru o afecțiune debilitantă, această lucrare validează și rolul critic al GM3 în vindecarea rănilor diabetice.

Abstract

Din 27 de milioane de americani diagnosticați cu diabet de tip 2 (T2D), mai mult de 6 milioane au răni cutanate cronice, care nu se vindecă, în special pe suprafața plantară, ducând la infecții bacteriene secundare și costând sistemului de sănătate mai mult de 25 miliarde de dolari (1, 2) . Numai în 2010, peste 70.000 de indivizi din Statele Unite cu T2D au suferit amputare (3). Sunt necesare o mai bună înțelegere a patologiei rănilor diabetice și noi intervenții pentru vindecarea rănilor afectate.

Rezultate

GM3S SNA Sinteza și caracterizarea.

După screeningul inițial al oligomerilor vizați GM3S (Fig. S1 și Tabelul S1) prin transfecție convențională de acid nucleic mediată de DharmaFECT1, cele mai bune cinci ARNsi cu knockdown> 70% au fost conjugate cu nanoparticule de aur pentru a produce SNA. Dintre acestea, două SNA au avut secvențe de oligonucleotide cu omologie perfectă între șoareci și GM3S uman și au prezentat o reducere> 75% atât a șoarecilor cât și a GM3S umană. Cea mai eficientă dintre aceste două, SNA 804 (GM3S SNA), a fost aleasă pentru toate studiile terapeutice (vezi mai jos).

SNA-urile au avut un miez de nanoparticule de aur cu diametrul de 13 ± 1 nm la care catena de sens a siARN-ului duplex a fost atașată printr-o legătură propiltiol. Suprafața rămasă a aurului a fost umplută cu oligoetilen glicol tiolat, care funcționează ca agent pasivant și oferă stabilitate suplimentară particulei în soluții biologice (Fig. 1A) (13, 14). Analizele EM de difuzare și transmisie dinamică a luminii au indicat că SNA GM3S avea un diametru mediu hidrodinamic de 28 ± 3 nm și a rămas dispersat în soluție (Fig. 1B). SNA GM3S a avut o încărcare medie de ARNsi de 40 ± 5 duplexuri de ARNsi pe particulă și fiecare duplex siARN de pe SNA a rămas hibridizat și stabil în soluție mai mult de 75 de zile (Fig. 1C). Luate împreună, aceste date indică faptul că nanoparticulele SNA GM3S sunt suficient de robuste, stabile și omogene pentru testarea aplicațiilor in vitro și in vivo.

Reprezentarea și caracterizarea SNA. (A) SNA-urile sunt miezuri de aur de 13 nm dens funcționalizate cu duplexuri siRNA tiolate foarte orientate, care vizează GM3S. Suprafața SNA este pasivată cu oligoetilen glicol pentru stabilitate coloidală. (B) Difuzarea dinamică a luminii confirmă că diametrul hidrodinamic este de ~ 32 nm. (C) Aproximativ 40 de duplexuri siRNA sunt ancorate la fiecare nanoparticulă de aur, iar cuantificarea peste 75 d arată că numărul duplexurilor siRNA complete rămâne statistic identic în acea perioadă de timp. Datele de stabilitate sunt reprezentate ca mijloace ± SD.

Spre deosebire de KC-urile imortalizate (mKC) tratate cu SNA netratate (NT) și fără sens (NS), SNA GM3S a redus atât ARNm GM3S, cât și proteina cu> 80% la o concentrație de 5 nM pe baza concentrației particulelor de aur și echivalentă cu 200 nM siRNA liber, deoarece R40 duplex siARN înconjoară nanoparticulele centrale). Knockdown a avut loc într-un mod dependent de doză (Fig. 2 A și B). În mKC epidermice primare, 2,5 nM GM3S SNA au doborât mARN-ul GM3S și proteinele cu 79% și, respectiv, 88%. Imunofluorescența confocală a șoarecilor imortalizați (Fig. 2C) și a KC-urilor umane (Fig. S2) cu anticorp anti-GM3 a confirmat eliminarea aproape completă a expresiei gangliozidelor GM3 după 72 de ore de tratament cu GM3S SNA. GM3S SNA a fost netoxic pentru mKC la toate concentrațiile testate, care a fost evaluat printr-un test de viabilitate a celulei de excludere în albastru tripan, inclusiv la concentrații de siRNA toxice pentru> 95% din mKC atunci când au fost tratați cu siRNA liber livrat cu reactivul de transfecție DharmaFECT1 (Fig. 2D).

GM3S SNA epuizează GM3S in vivo prin calea RNAi.

Aplicarea topică a GM3S SNA previne vindecarea întârziată a rănilor la șoarece DIO. (A) Imagini clinice reprezentative ale rănilor. (B) Măsurătorile computerizate ale zonei deschise a plăgii au fost efectuate folosind ImageJ (n = 8 răni pe zi și grup de tratament). ** colorarea P +) au fost măsurate prin morfometrie computerizată. Au fost analizate cel puțin șase secțiuni pentru fiecare grup de tratament (n = 6). Datele afișate sunt mijloace ± SE. * P ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –31). SNA-urile siARN sunt constructe unice, foarte anionice, care nu necesită modificări chimice suplimentare pentru a facilita transportul prin stratul cornos sau intrarea în celule. Construcțiile SNA s-au dovedit a fi extrem de eficiente și nu prezintă toxicitate aparentă în aplicațiile de reglare a genelor in vivo (17, 18), inclusiv în acest studiu cu șoareci diabetici. În ciuda absenței unei bariere epidermice la nivelul plăgii în sine, eșecul GM3S siRNA liber de a îmbunătăți vindecarea rănilor sugerează că capacitatea SNA GM3S de a traversa bariera epidermică la marginea plăgii și de a-și doborî ținta joacă un rol important în accelerarea regională Migrația și proliferarea KC.

Impactul SNA GM3S este paralel cu efectul K3 GM3S la șoarecele DIO GM3S -/- rănit, care rezistă dezvoltării rezistenței la insulină și a afectării vindecării rănilor, în ciuda obezității induse de dietă (4). O atenție deosebită s-a concentrat asupra anomaliilor vasculare în patogeneza vindecării întârziate a rănilor în diabet (36 ⇓ –38). Observația că tratamentul SNA cu GM3S aproape dublează celulele CD31 + din răni oferă dovezi că suprimarea regională a sintezei GM3 poate juca un rol și în stimularea angiogenezei și susține inhibarea demonstrată anterior a activării receptorului VEGF-2 și a angiogenezei de către GM3 (36 ).

Munca desfășurată în acest studiu este importantă deoarece (i) confirmă rolul cheie al GM3 ca mediator critic al rezistenței la insulină și stabilește epuizarea nivelurilor de GM3 ca modalitate de tratament pentru ulcerele diabetice, (ii) reprezintă o aplicație topică neidentificată anterior., O strategie bazată pe RNAi pentru a accelera închiderea plăgii la șoareci și (iii) oferă planul unei platforme care poate fi utilizată pentru a trata orice boală legată de piele cu o bază genetică. Rezultatele acestei investigații sunt un prim pas interesant către dezvoltarea unor terapii pe bază de oligonucleotide pentru tulburări ale pielii, deschizând calea pentru studii suplimentare privind eficacitatea SNA în modele animale mai complexe.

Metode

Sinteza și caracterizarea SNA.

Treisprezece duplexuri ARNsi care vizează secvențe omoloage în ARNm GM3S murin și uman au fost sintetizate și introduse în mKC imortalizate folosind reactivul de transfecție DharmaFECT1 (GE Life Sciences) și selectate pentru eliminarea ARNm și proteine ​​GM3S (Fig. S1). Cele mai eficiente secvențe de siARN au fost dens conjugate pe nanoparticule de aur pentru a face SNA-uri care vizează GM3S (detalii în textul SI, sinteza și caracterizarea SNA). Difuzarea dinamică a luminii (Malvern) și transmisia EM (Hitachi 2300) au fost utilizate pentru a caracteriza diametrul hidrodinamic. Un test Quant-iT OliGreen (Life Technologies) a fost utilizat pentru a determina numărul de duplexuri pe nanoparticule. Stabilitatea duplexului siRNA pe SNA peste 75 d a fost caracterizată folosind protocoale de dezbridare și centrifugare a ureei (detalii în textul SI, sinteza și caracterizarea SNA). Expresia GM3S a fost analizată prin RT-PCR și Western blot după ce mKC-urile imortalizate au fost tratate cu SNAs GM3S (detalii în textul SI, Studiile in vitro și Fig. S1). Expresia GM3 a fost selectată prin imunofluorescență confocală cu anticorp anti-GM3 (Seikagaku Biobusiness Corp.). Toxicitatea siARN-ului și SNA-urilor lipofectate a fost evaluată prin testul de viabilitate a celulei de excludere trypan albastru (Sigma).

Testele de proliferare și migrație in vitro.

MKC primare au fost plasate în plăci cu 96 de godeuri (2 × 10 3 celule pe godeu) în mediu complet fără ser CnT07 (Zen-Bio) cu și fără supliment de d-glucoză (concentrație finală de 18 mM). Celulele au fost tratate cu 2 nM GM3S sau NS SNA și proliferarea a fost evaluată zilnic timp de 5 zile folosind un test de tetrazoliu solubil în apă conform instrucțiunilor producătorului (Clontech). Pentru testul de migrare, KC au fost dens placate după tratament cu 2 nM GM3S sau NS SNA timp de 48 de ore în mediu complet fără ser. Mitomicina C (5 μg/mL) a fost utilizată pentru a incuba celulele timp de 1 oră înainte de a se face o zgârietură cu lățimea de 500 μm. Închiderea plăgii a fost realizată în serie pe un microscop cu lumină inversată (Nikon) la momentul inițial și după 48 și 60 de ore după zgârieturi.

În modelul Vivo pentru vindecarea rănilor.

Toate studiile la șoareci au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Northwestern (NU). Șoarecii masculi C57BL/6 (laboratorul Jackson) au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (60% grăsimi (procentaj din greutatea totală); Harlan Teklad] ad libitum timp de cel puțin 12 săptămâni începând cu vârsta de 6 săptămâni, moment în care șoarecii erau obezi (greutate medie de 43 g) și diabetici, care au fost evaluați prin testarea toleranței la glucoză cu cel puțin 1-2 săptămâni înainte de experimentare ca descris anterior (4). Pe suprafața dorsală a fiecărui șoarece s-au făcut două plăgi circulare, cu diametrul de 6 mm, cu grosime completă, iar în jurul fiecărei plăgi au fost așezate atele din silicon (SI Text, Studii in vivo).

Analize de imunoblotare, RT-PCR și 5'-RLM-RACE.

Imunoblotarea și analizele RT-PCR au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (4, 17) (text SI, studii in vivo); Analiza 5′-RLM-RACE a fost efectuată folosind un kit de la Invitrogen folosind protocoalele producătorului (text SI, studii in vivo).

Analize clinice, histologice și imunohistochimice.

Rănile au fost șterse ușor cu apă pentru a îndepărta SNA-urile și resturile nepenetrate, iar fotografiile au fost făcute la rănire și la fiecare 48 de ore după aceea, folosind fotografii standardizate pentru distanță și iluminare. Plăgile au fost disecate la nivelul mușchilor și încorporate în parafină pentru analize histologice și imunohistochimice de rutină. Toate preparatele histologice și imunohistochimice au fost efectuate la Laboratorul de morfologie și fenotipare a Centrului de cercetare a bolilor pielii de la NU sau Laboratorul de histologie și fenotipare a șoarecilor sau a șoarecilor. Secțiunile de țesut de 4 μm colorate cu H & E au fost realizate cu ajutorul unui sistem TissueFAXS (TissueGnostics; NU Cell Imaging Facility). Decalajul epidermic a fost definit ca decalajul maxim dintre marginile anterioare ale migrației epidermice, cu un decalaj epidermic zero care înseamnă reepitelializare completă. Țesutul de granulare a fost definit de țesutul plăgii îmbogățit vascular între epidermă și țesutul adipos/muscular. Toate imaginile au fost analizate de doi observatori instruiți și orbi (detalii în SI Text, Studii In Vivo).

SNA Biodistribuire.

Pentru a determina absorbția SNA în organe după livrarea topică, rinichii, ficatul, plămânii, ganglionii limfatici, splina și suprafața totală a pielii rănite au fost recoltate la 12 zile după rănire, iar conținutul de aur SNA a fost cuantificat prin analiza MS cu plasmă cuplată inductiv (text SI, în Studii Vivo). Concentrația de nanoparticule din fiecare organ a fost raportată ca procentul SNA aplicat local per organ normalizat la greutatea organului (Fig. S7).