Etnofarmacologie

Editat de
Aiping Lu

Universitatea Baptistă din Hong Kong, Hong Kong

Revizuite de
Ru Yan

Universitatea din Macao, China

Rajendra Karki

Sf. Jude Children's Research Hospital, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

analize

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de biologie farmaceutică, Institutul de Farmacie și Biochimie, Universitatea din Mainz, Mainz, Germania
  • 2 Laborator cheie de stat de cercetare a calității în medicina chineză, Universitatea de Știință și Tehnologie din Macao, Macao, China

Introducere

Principalele caracteristici ale cancerului sunt creșterea necontrolată și metastaza celulelor mutante ducând în cele din urmă la moartea pacienților (Stratton și colab., 2009). Organizația Mondială a Sănătății (OMS) a estimat în jur de 8,2 milioane de decese și 14,1 milioane de cazuri de cancer nou diagnosticate în 2012 la nivel mondial. Conform rapoartelor American Cancer Society, se estimează că 1.688.780 de cazuri noi de cancer și 600.920 de decese cauzate de cancer vor apărea în Statele Unite în Siegel și colab. (2017). În mod remarcabil, țările subdezvoltate au avut cea mai mare incidență a cazurilor noi (8,0 milioane) și cele mai ridicate rate de deces (5,3 milioane). Factorii de risc ai stilului de viață precum fumatul, obezitatea și inactivitatea fizică vor provoca probabil o creștere suplimentară a cazurilor de cancer în viitor (Jemal și colab., 2011).

Chimioterapia este unul dintre pilonii de gestionare a cancerului, adesea efectuată prin administrarea simultană a unei combinații de regimuri de diverși agenți. Cu toate acestea, rata de succes este limitată din cauza rezistenței la medicamente a celulelor tumorale și a toxicităților ridicate legate de tratament (Jabbour și colab., 2009; Eghtedar și colab., 2013). Datorită efectelor secundare severe, medicamentele chimioterapeutice nu pot fi administrate în doze suficient de mari pentru a elimina în mod fiabil toate celulele tumorale din corp, ceea ce duce la indicii terapeutici îngustați.

În plus față de toxicitatea severă, MDR reprezintă o problemă majoră a eșecului chimioterapiei. MDR se caracterizează prin rezistență încrucișată la multe medicamente anticanceroase care nu au legătură structurală și mecanicistă (Gottesman și Ling, 2006; Gillet și colab., 2007; Kuete și colab., 2015). P-glicoproteină (P-gp) codificată de ABCB1/MDR1 gena este suprareglată în multe tumori rezistente clinic și refractare și este denumită unul dintre cele mai importante mecanisme ale MDR (Kuete și colab., 2015). Supraexprimarea glicoproteinei P (P-gp) este legată de efluxul accelerat de agenți chimioterapeutici. Acest proces este alimentat de ATP ca sursă de energie pentru a efectua efluxul de droguri. Direcționarea P-gp și a altor pompe de eflux din familia transportoare ABC reprezintă o strategie promițătoare pentru a reveni la MDR și a crește eficiența medicamentelor pentru chimioterapie (Abdelfatah și Efferth, 2015). Elucidarea structurii cristaline a P-gp murin (Aller și colab., 2009) și dezvoltarea modelelor de omologie a P-gp uman bazate pe structura aminoacidului murin au dat informații valoroase pentru a înțelege mai bine legarea poli-specifică a medicamentului în mai multe conformații ale P-gp (Aller și colab., 2009; Zeino și colab., 2014; Kadioglu și colab., 2016).

Într-un efort de a dezvolta noi medicamente cu specificitate tumorală mai mare și toxicitate mai mică pentru țesuturile normale, produsele naturale servesc ca sursă valoroasă (Newman și Cragg, 2012; Cragg și Newman, 2013). Biosinteza produselor naturale depinde fie de adaptarea evolutivă la mediile înconjurătoare, fie ca mecanism de apărare pentru supraviețuirea organismelor (Maplestone și colab., 1992; Efferth și colab., 2007). Pot fi de origine vegetală, animală, marină sau microorganismică. Bioactivitatea produselor naturale se bazează pe presupunerea că acestea au activitate specifică față de diferite proteine ​​țintă (Venkatraman, 2010). Sarcina provocatoare a farmacologiei este identificarea țintelor legate de boală care sunt relevante pentru intervenția terapeutică la pacienții umani (Cragg și Newman, 2013). Aproximativ 75% dintre agenții anticanceroși aprobați se bazează într-adevăr pe produse naturale (Newman și Cragg, 2012; Cragg și Newman, 2013), ceea ce este un indiciu puternic că produsele naturale reprezintă un rezervor promițător pentru dezvoltarea medicamentelor.

Neferina este un alcaloid de bisbenzilizochinolină izolat din embrionii verzi de semințe de Lotus (Nelumbo nucifera Gaertn). Această plantă a fost consumată în India și China încă din cele mai vechi timpuri. În medicina tradițională chineză, a fost utilizat pe scară largă pentru tratarea tulburărilor nervoase, a insomniei, a febrelor mari cu neliniște, precum și a bolilor pulmonare și cardiovasculare, cum ar fi hipertensiunea arterială, ateroscleroza, restenoza și aritmia (Sridhar și Bhat, 2007; Jun și colab., 2016; Sharma și colab., 2017). Diverse studii au evidențiat și efectul potențial anti-cancer al neferinei (Huang și colab., 2011b; Yoon și colab., 2013; Poornima și colab., 2014; Xu și colab., 2016). În acest studiu, am evaluat efectul neferinei în ceea ce privește inhibarea P-gp via in Silicon andocare moleculară, QSAR și in vitro teste de citotoxicitate și analize de captare a substratului P-gp în celulele canceroase rezistente la medicamente.

Materiale și metode

Cultură de celule

Toate celulele au fost obținute din colecția American Type Culture (Rockville, MD, SUA), cu excepția cazului în care se specifică altfel. Tipurile de celule canceroase MCF-7, A549 și HCT-8 rezistente la taxol și doxorubicină au fost achiziționate de la KeyGEN BioTECH, China. Toate mediile au fost suplimentate cu 10% ser fetal bovin și antibioticele penicilină (50 U/ml) și streptomicină (50 μg/ml; Invitrogen, Paisley, Scoția, Marea Britanie). Toate culturile de celule au fost incubate la 37 ° C într-un incubator de CO2 umidificat 5%.

Testele de citotoxicitate

Neferina a fost dizolvată în DMSO la concentrații finale de 100 mmol/L și stocată la -20 ° C înainte de utilizare. Citotoxicitatea a fost evaluată utilizând bromura de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium (MTT) (5,0 mg/ml). Pe scurt, 4 × 103 celule au fost însămânțate pe godeu în plăci cu 96 de godeuri înainte de tratamentul medicamentos. După cultura peste noapte, celulele au fost apoi expuse la diferite concentrații de neferină (0,039-100 μmol/L) timp de 72 de ore. Celulele fără tratament medicamentos au fost utilizate ca martor. Ulterior, MTT (10 μL) a fost adăugat la fiecare godeu și incubat la 37 ° C timp de 4 h, urmat de adăugarea de 100 μL tampon de solubilizare (10% SDS în 0,01 mol/L HCI) și incubare peste noapte. A570 nm a fost determinat din fiecare godeu în ziua următoare. Procentul de viabilitate celulară a fost calculat utilizând următoarea formulă: Viabilitatea celulei (%) = Atreat/Acontrol × 100. Datele au fost obținute din trei experimente de triplare independente. Media reprezentată ca ± SD. Valoarea IC50 este obținută direct din interceptarea dintre curba de creștere și o linie orizontală la 50% din viabilitatea în graficul prismei.

Andocare moleculară

Modelul de omologie generat anterior de P-gp uman (Tajima și colab., 2014) a fost utilizat pentru studii de andocare moleculară cu AutoDock 4 (Morris și colab., 2009) pe buzunarul de legare a medicamentelor. Reziduurile de la buzunarul de legare a medicamentelor au fost His61, Gly64, Leu65, Met69, Ser222, Leu304, Ile306, Tyr307, Phe336, Leu339, Ile340, Ala342, Phe343, Gln725, Phe728, Phe732, Leu762, Thr837, Ile868, Thr, Leu975, Phe978, Ser979, Val982, Gly984, Ala985, Met986, Gly989, Gln990 și Ser993 (Aller și colab., 2009). A fost aleasă o hartă de rețea pentru a acoperi aceste reziduuri. Trei calcule de andocare independente pentru neferină și R123 au fost efectuate cu 2.500.000 de evaluări și 250 de rulări folosind algoritmul genetic Lamarckian. LBE-urile și constantele de inhibiție prezise au fost obținute din fișierele jurnal de andocare (dlg) și s-au calculat valorile medii ± SD. Pentru vizualizarea rezultatelor de andocare, au fost utilizate dinamica moleculară vizuală (VMD). Software-ul VMD a fost dezvoltat cu sprijinul NIH de către grupul de biofizică teoretică și computațională de la Institutul Beckman, Universitatea din Illinois la Urbana-Champaign. Pentru calculele co-andocării, R123 și neferina au fost selectate pentru a evalua efectul compusului pre-andocat asupra energiilor de legare și a poziției de andocare.

QSAR și predicția toxicității

Software-ul Stardrop (Optibrium, Cambridge, Marea Britanie) a fost utilizat pentru a evalua proprietățile de drogare și toxicitatea neferinei. Modulul ADME QSAR al Stardrop a fost utilizat pentru a prezice proprietățile de drogare, în timp ce modulul Derek Nexus a fost utilizat pentru a prezice toxicitățile. Modulul ADME QSAR ajută la prezicerea unei game largi de proprietăți ADME și fizico-chimice utilizând o suită de modele QSAR de înaltă calitate. Modulul Derek Nexus implică o predicție bazată pe cunoștințe a toxicităților cheie prin utilizarea datelor din surse publicate și nepublicate. Derek Nexus identifică relațiile structură-toxicitate ale compușilor care prezic potențialul de toxicitate. S-a calculat probabilitatea ca un compus să provoace toxicitate pe baza a mai mult de 40 de criterii finale, inclusiv mutagenitate, hepatotoxicitate și cardiotoxicitate.

Rezultatele din modulele ADME QSAR și Derek Nexus au fost comparate cu cele ale verapamilului. HBD, HBA, MW, logP, logD, TPSA, legături rotative, HIA, hERG (canal de potasiu) IC50 au fost selectate ca descriptori de drogare. Activitatea hERG este crucială pentru potențialele de acțiune cardiacă, iar blocarea hERG este legată de aritmia cardiacă și cardiotoxicitatea. Parametrii care îndeplinesc proprietățile de drogare au fost etichetați verzi (donator de legături H-5 celule fiecare godeu și cultivate timp de 24 de ore la 37 ° C într-o atmosferă conținând 5% CO2. La confluență, celulele MDR au fost incubate cu sau fără modulator (10 μM de verapamil) și medicament (1, 2, 5 și 10 μM de neferină) timp de 4 ore la 37 ° C. Ulterior, s-au adăugat 5 μg/mL de R123 la fiecare godeu și godeurile au fost incubate încă o oră la 37 ° C. Acumularea de R123 a fost oprită prin spălarea celulelor de cinci ori cu PBS rece ca gheața. Celulele au fost apoi resuspendate în 400 μL PBS pentru analiza citometriei în flux. Fluorescența intracelulară a fost măsurată folosind un citometru de flux la o lungime de undă de excitație de 488 nm și lungimea de undă a emisiilor de 525 nm. Toate achizițiile și analiza datelor au fost efectuate cu CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA) cu cel puțin trei experimente independente. Rezultatele au fost prezentate ca medie a intensității fluorescenței.

Analize statistice

Rezultatele au fost exprimate ca medii ± SD așa cum s-a indicat. Diferența a fost considerată statistic semnificativă atunci când p-valoarea a fost mai mică de 0,05. Elevi t-analiza test a fost utilizată pentru comparație între diferite grupuri.

Rezultate

Test de citotoxicitate

Neferina a dat valori IC50 în domeniul micromolar scăzut atât pentru liniile celulare sensibile, cât și pentru cele rezistente. Interesant, valorile IC50 pentru sub-liniile rezistente au fost chiar mai mici decât cele ale liniilor celulare sensibile, fenomen cunoscut sub numele de sensibilitate colaterală (Saeed et al., 2013). Rezultatele sunt rezumate în Figura 1.

FIGURA 1. Citotoxicitatea neferinei către MCF-7 (A) rezistent la paclitaxel și sensibil, MCF-7 rezistent la doxorubicină și sensibil (B), rezistent la paclitaxel și sensibil A549 (C), HCT8 rezistent la paclitaxel și sensibil (D).

Citometrie în flux

Neferina a crescut absorbția R123 în toate liniile celulare rezistente la medicamente (MCF-7 rezistent la paclitaxel, celule de cancer mamar MCF-7 rezistente la doxorubicină, celule canceroase pulmonare A549 rezistente la paclitaxel și celule canceroase ale colonului HCT8 rezistente la paclitaxel) într-o manieră comparabilă, la fel ca binecunoscutul inhibitor P-gp verapamil. Chiar și concentrațiile scăzute (1 și 2 μM) au dat o creștere comparabilă a absorbției R123 ca verapamil (10 μM) în celulele MCF-7 rezistente la paclitaxel (Figura 2) sau rezistente la doxorubicină (Figura 3). În celulele A549 rezistente la paclitaxel, neferina de 2, 5 și 10 μM a dezvăluit creșteri comparabile ale R123 comparativ cu verapamilul (Figura 4). Concentrațiile scăzute de neferină au fost suficiente pentru a crește absorbția R123 în celulele HCT8 rezistente la paclitaxel comparabile cu verapamil (Figura 5).

FIGURA 2. Analiza de absorbție R123 a neferinei pe celulele cancerului de sân MCF-7 rezistente la paclitaxel. (A) A reprezentat datele de citometrie în flux brut ale (B), in timp ce (B) este analiza cantitativă a acestor date de citometrie în flux. ∗∗∗ p ∗∗∗ p ∗∗∗ p ∗∗∗ p Cuvinte cheie: cancer, chimioterapie, rezistență la medicamente, produse naturale, neferină, glicoproteină P

Citare: Kadioglu O, Law BYK, Mok SWF, Xu S-W, Efferth T și Wong VKW (2017) Mod de acțiune Analize ale neferinei, un alcaloid de bisbenzilisoquinolină al lotusului (Nelumbo nucifera) împotriva celulelor tumorale multirezistente. Față. Farmacol. 8: 238. doi: 10.3389/fphar.2017.00238

Primit: 25 octombrie 2016; Acceptat: 18 aprilie 2017;
Publicat: 05 mai 2017.

Aiping Lu, Universitatea Baptistă din Hong Kong, Hong Kong

Rajendra Karki, St. Spitalul de cercetare pentru copii Jude, SUA
Ru Yan, Universitatea din Macao, China