Informații despre articol

H. Beaufrère, Științe clinice veterinare, LSU-Școala de Medicină Veterinară, Skip Bertman Drive, Baton Rouge 70808, LA, SUA. E-mail: [e-mail protejat]

experimentală

Abstract

Similar oamenilor, păsările au o susceptibilitate ridicată la ateroscleroză și prezintă probabil cea mai mare prevalență și severitate a leziunilor aterosclerotice la animalele vertebrate în condiții de captivitate standard. 4.6 Modelele aviare nonpsittacine au fost utilizate pe scară largă pentru investigațiile experimentale ale leziunilor aterosclerotice și ale complicațiilor fiziologice asociate acestora la specii precum porumbelul White Carneau (Columba livia domestica), Prepeliță japoneză (Coturnix japonica), și pui (Gallus gallus domesticus). 38,40,41,47

Alte modele animale de ateroscleroză implică în principal specii de mamifere, cum ar fi șoareci, șobolani, hamsteri, iepuri, porci, cobai, câini și primate neumane. 40,47 Deși împărtășesc fiziologie lipidică similară și sunt mai aproape de oameni decât păsările, modelele de mamifere (cu excepția primatelor) rareori dezvoltă leziuni spontane avansate în circumstanțe normale și atunci când sunt hrăniți cu o dietă standard. Prin urmare, rezultatele obținute din experimente folosind animale consangvinizate și modificate genetic nu pot fi ușor traduse în leziuni spontane la aceeași specie și la oameni.

Aici, raportăm inducția dietetică experimentală a leziunilor aterosclerotice avansate la papagalii Quaker (Myiopsitta monachus), o mică specie de psittacină susceptibilă la ateroscleroză spontană.

Materiale și metode

Proiectare experimentală

Tabelul 1. Analiza nutrițională a dietelor aterogene și de control utilizate într-un experiment privind ateroscleroza indusă de dietă la papagalii Quaker (% greutate uscată).

Tabelul 1. Analiza nutrițională a dietelor aterogene și de control utilizate într-un experiment privind ateroscleroza indusă de dietă la papagalii Quaker (% greutate uscată).

Colectarea și analiza probelor

O probă de sânge de 1 ml a fost obținută lunar de la fiecare pasăre din vena jugulară dreaptă și plasată în tuburi heparinizate (Microtainer; BD, Franklin Lakes, NJ). Pentru analize biochimice, sângele a fost centrifugat timp de 10 minute la 1000 × g, iar plasma a fost recoltată și depozitată la –80 ° C până la analiză. Probele au fost utilizate pentru a măsura volumul celulelor ambalate, profilul biochimiei plasmatice aviare (rotor Avian/Reptile, Abaxis VetScan; Abaxis, Union City, CA), trigliceride, colesterol total și lipoproteine ​​cu densitate înaltă (HDL) (Ortho Vitros 250 Chemistry Analyzer, Rochester, NY). Concentrațiile de lipoproteine ​​cu densitate foarte mică (VLDL) și lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL) au fost obținute folosind formula Friedewald. 13 O probă de sânge mai mare (3 ml) a fost obținută sub anestezie anterioară până la eutanasie. Activitatea proteinei de transfer a colesteril esterului plasmatic (CETP) a fost măsurată utilizând o analiză comercială conform instrucțiunilor producătorului (ab65383; Abcam, Cambridge, Marea Britanie) și o hemoleucogramă completă efectuată utilizând tehnica Leukopette. 11

Aorta ascendentă și arterele brahiocefalice și pulmonare au fost colectate în decurs de 15 minute de eutanasie, iar secțiunile au fost fixate în 10% formalină neutră tamponată pentru histopatologie și 2% paraformaldehidă și 1,25% glutaraldehidă într-un tampon de cacodilat 0,1 M pentru transmiterea microscopiei electronice (TEM) . Inima și ficatul au fost, de asemenea, colectate și fixate în 10% formalină tamponată neutră. Secțiuni proaspete suplimentare de artere și ficat au fost depozitate la –80 ° C pentru măsurarea colesterolului. Sexul a fost determinat la necropsie. Țesuturile fixate pe formalină au fost procesate în mod obișnuit în parafină. Secțiuni de cinci micrometri au fost tăiate și colorate cu hematoxilină și eozină, von Kossa pentru sărurile de calciu și tricromul lui Masson pentru colagen. Secțiunile congelate de formalină ale arterelor au fost, de asemenea, colorate cu roșu ulei O (ORO) pentru lipide. Țesuturile arteriale fixate pentru microscopia electronică au fost prelucrate, secționate și colorate folosind tehnici standard descrise anterior pentru probele de arteră psittacină. 8 În plus, secțiunile groase de 0,5 μm obținute din blocurile utilizate pentru secțiunile TEM au fost colorate cu albastru de toluidină. Secțiunile TEM au fost montate pe rețele de cupru acoperite cu colodion, colorate cu citrat de plumb Reynolds și au fost realizate cu un microscop electronic cu transmisie JEM-1011 (JEOL, Tokyo, Japonia).

Tipurile de leziuni aterosclerotice au fost clasificate în tipurile I-V în conformitate cu un sistem de clasificare publicat la papagali care reflectă clasificarea AHA. 8 Inima și ficatul au fost evaluate pe secțiuni histopatologice și s-au evaluat, de asemenea, aproximativ 15 până la 20 de artere coronare intramyocardice per inimă de aproximativ 40 până la 250 μm în diametru. Colesterolul total a fost măsurat în probe arteriale proaspete folosind un test comercial conform instrucțiunilor producătorului (ab65359; Abcam). Leziunile au fost, de asemenea, comparate calitativ cu leziunile spontane la 16 papagali Quaker de companie (interval de vârstă, 2-16,5 ani; sex: 6 bărbați, 3 femele, 7 necunoscuți) obținute de la un laborator de patologie veterinară (Zoo/Exotic Pathology Service, Sacramento, CA).

Analize statistice

Conținutul de colesterol hepatic și activitatea plasmatică CETP între grupuri au fost comparate folosind un test Kruskal-Wallis. Măsurile repetate de-a lungul timpului au fost analizate utilizând modele mixte liniare cu papagali ca variabilă aleatorie și tratament, timp și termeni polinomiali ca variabile fixe atunci când este cazul. Conținutul de colesterol arterial a fost analizat în mod similar, dar cu timpul și artera ca efecte fixe. Eterogenitatea variației și dependența dintre observații au fost modelate utilizând funcții de varianță și structuri de corelație serială, atunci când este cazul. Modelele concurente au fost evaluate pe baza criteriului informației Akaike, iar presupunerile modelului au fost evaluate pe parcele reziduale și cuantile. Comparații post-hoc parametrice și nonparametrice au fost efectuate cu o ajustare Tukey. Corelațiile dintre tipurile de leziuni din arterele aortei și brahiocefalice și colesterolul plasmatic la eutanasie sau conținutul de colesterol arterial au fost evaluate utilizând un coeficient de corelație Kendall τ. Corelațiile dintre colesterolul plasmatic la eutanasie și concentrațiile colesterolului arterial și hepatic au fost evaluate utilizând un coeficient de corelație Spearman. A P 32

Rezultate

Patru din 16 papagali Quaker au fost femele, iar 1 femelă a fost în fiecare grup, cu excepția grupului de 8 luni. Papagalii Quaker au consumat zilnic o medie de 9,9 g (interval de încredere de 95% [CI], 9,4-10,3) de pelete (modele mixte numai pentru interceptare). A existat un efect semnificativ de interacțiune între timp și tratament asupra consumului zilnic de alimente (t = 15,6, P 2 + 0,4 × timp 3; P 2 (timp) 2 × 0,87). Chiar dacă termenul cub nu a fost semnificativ, a adus o netezire substanțială a curbei și o potrivire globală mai bună la date. Concentrația medie de colesterol a atins un platou la aproximativ 3 până la 4 luni (Fig. 1).

Figura 1. Concentrația plasmatică a colesterolului în timp reprezentată de graficele box-by-side cu o linie de regresie polinomială. Concentrația medie a crescut în timp și a atins un platou la 3 până la 4 luni.

Concentrația plasmatică medie de colesterol LDL la păsările martor a fost constantă în timp, cu o medie (DE) de 0,5 (0,4) mmol/L și, în general, a fost mai mică decât la papagalii din grupurile de tratament (P 2 + 0,2 × timp 3; P = .3, P 2 (timp) 2 × 0,89). De asemenea, concentrația medie de LDL a atins un platou la aproximativ 3 până la 4 luni (Fig. 2).

Figura 2. Concentrația de colesterol în lipoproteine ​​cu densitate scăzută (LDL) în timp reprezentată de boxploturi alăturate cu o linie de regresie polinomială. Concentrația medie a crescut în timp și a atins un platou la 3 până la 4 luni.

Concentrațiile plasmatice ale colesterolului HDL nu s-au modificat semnificativ în timp (t = –0,5, P = .61) sau între grupurile de tratament și de controlt = 0,19, P = .85), cu o mediană (interval intercuartil) de 3,8 (2,7) mmol/L (Fig. 3). Concentrațiile plasmatice medii ale trigliceridelor și ale colesterolului VLDL nu s-au modificat semnificativ între tratament și grupurile de control (t = –4,8, P = .39) dar ușor scăzută în timp [trigolceride [mmol/L] = 1,58 - 0,05 × timp, toate P FIG. 4). HDL a fost tipul predominant de colesterol în plasmă înainte de începerea studiului cu furaje, dar LDL a devenit preponderent în dieta aterogenă.

Figura 3. Concentrația de colesterol în lipoproteine ​​cu densitate ridicată (HDL) în timp reprezentată de comploturi box-by-side. Nu a fost identificată nicio tendință semnificativă în timp.

Figura 4. Concentrația trigliceridelor în timp cu o linie de regresie liniară reprezentată de graficele box-by-side. Concentrația medie a scăzut liniar în timp.

Niciun alt parametru biochimic și hematologic nu a arătat nicio diferență semnificativă în timp între grupurile de control și cele de tratament (toate P > .05).

Activitatea CETP a fost detectată în toate probele de plasmă ale papagalilor Quaker. Deși activitatea CETP a fost în general mai mare la papagalii din dieta aterogenă decât din dieta de control, diferența nu a fost semnificativă (testul Kruskal-Wallis, P = .298) (Fig. 5). Mediana (intervalul interquartilei) a fost 45,80 (38,9-65,0) nmol/mL/h și 99,40 (46,10-148) nmol/mL/h în grupurile de control și, respectiv, de tratament.

Figura 5. Activitatea proteinei de transfer a colesterilesterului plasmatic (CETP) în timp. Deși activitatea plasmatică CETP a fost mai mare la păsările tratate decât la păsările martor, diferențele nu au fost semnificative.

Figura 6. Concentrația de colesterol hepatic în timp. Grupul de 4 până la 8 luni a diferit semnificativ de controale (*).

Figura 7. Concentrația colesterolului arterial în timp cu o linie de regresie liniară (obținută din componenta fixă ​​a modelului mixt; săgeată: în exterior). Fiecare punct de timp are 6 puncte (unele valori se pot suprapune) care corespund la 2 probe arteriale, aorta și arterele brahiocefalice, pentru 3 păsări. Concentrația colesterolului arterial a crescut liniar în timp.

Leziunile apărute spontan la alți 16 papagali Quaker au apărut mai organizate, iar diferitele zone ale fibroateromilor au fost mai bine definite în comparație cu leziunile experimentale. De asemenea, leziunile experimentale de tipurile III-IV au fost mai difuze, vacuolate și de obicei au implicat întreaga circumferință a arterelor, în timp ce leziunile spontane de acest tip au fost de obicei mai circumscrise și mai puțin vacuolate. În cele din urmă, calcificarea a fost adesea mai avansată în leziunile spontane decât în ​​leziunile experimentale, iar metaplazia și osificarea crondroidă nu au fost observate în acestea din urmă. Leziunile avansate caracterizate ca tip V au apărut histologic similare între ateroscleroza spontană și experimentală la papagalii Quaker.

Nici o anomalie histologică, cu excepția leziunilor aterosclerotice coronare, nu a fost evidentă în inimile oricăreia dintre cele 16 păsări. Păsările din grupurile de control și cele de 2 luni nu au avut ateroscleroză observată în arterele coronare. La 4 luni, toate păsările au avut modificări aterosclerotice, în principal leziuni de tip III, dar cu obstrucție completă a lumenului arterial în unele artere coronare prin unele leziuni de tip III-IV. La 6 luni, 2 păsări aveau leziuni avansate de tip IV, caracterizate prin pereți arteriali segmentari înlocuiți aproape transmural de celule de spumă și lipide extracelulare, dar nu au fost observate leziuni aterosclerotice la 1 pasăre. La 8 luni, doar 1 pasăre a prezentat leziuni aterosclerotice coronare de tip III. În secțiunile hepatice, vacuolizarea hepatocelulară proeminentă a fost observată la 2 păsări, 1 la 6 luni și 1 la 8 luni.

Figura 14. Aortă; Papagal quaker, grup de 2 luni. Micrografie electronică a unei leziuni de tip I, citoplasma unei celule endoteliale care prezintă un număr crescut de corpuri Weibel-Palat (săgeți) și vezicule pinocitice (vârfuri de săgeți). N, nucleu. Bară = 100 nm. Pata de orceină-uranil-plumb. Figura 15. Artera brahiocefalică; Papagal quaker, grup de 6 luni. Micrografie electronică a unei leziuni de tip V, celule de spumă derivate din macrofage cu câțiva lizozomi (săgeți). Bară = 2 μm. Pata de orceină-uranil-plumb. Figura 16. Artera brahiocepalică; Papagal quaker, grup de 4 luni. Micrografie electronică a unei leziuni de tip IV, nucleu lipidic compus din lipide extracelulare (ExL), cristale de colesterol (Ch) și granule mici de calciu (săgeți). Bară = 500 nm. Pata de orceină-uranil-plumb. Figura 17. Artera brahiocefalică; Papagal quaker, grup de 6 luni. Micrografie electronică a unei leziuni de tip IV, capac fibros compus din celule musculare netede alungite (SMC), colagen (Co) și fibre de elastină (El); este de asemenea vizibilă o celulă asemănătoare fibroblastului (Fi). Bară = 2 μm. Pata de orceină-uranil-plumb.

Discuţie

Printre modelele aviare de ateroscleroză, histopatologia și patologia ultrastructurală au fost raportate în principal la porumbeii White Carneau și prepelițele japoneze. 3,16,18 –20,23,38 Deși papagalii și prepelițele dezvoltă în principal leziuni în aorta ascendentă și arterele brahiocefalice, porumbeii dobândesc preferențial leziuni în aorta toracică inferioară, în special la bifurcația celiacă. 4,18,20

În concluzie, papagalii Quaker pot fi un model util de ateroscleroză pentru papagali și oameni, deoarece această specie este mică, are un consum redus de alimente (10 g/zi) și dezvoltă rapid leziuni aterosclerotice avansate cu hrănire cu colesterol care seamănă cu leziunile găsite atât la oameni, cât și la oameni. alte modele aviare. În plus, leziunile aterosclerotice avansate (tip V) induse experimental sunt similare cu leziunile care se dezvoltă spontan în cadrul aceleiași specii.

Mulțumiri

Mulțumim domnului Rich Bonkowski și dr. Randal Brue (Kaytee) pentru formularea și furnizarea dietelor aterogene și de control, Divizia LSU-Divizia de Medicină Animală de Laboratoriu pentru îngrijirea excelentă a acestei colonii de papagali Quaker, Dr. João Brandão pentru ajutorul său tehnic, Dr. Ying Xiao (Miscroscopy Center) pentru prelucrarea țesuturilor pentru microscopie electronică de transmisie, Dr. Brian Marx (Statistici experimentale, LSU) pentru sfaturile sale privind analiza statistică și Dr Drury Reavill (Zoo/Exotic Pathology, Sacramento) pentru furnizarea cazurilor de ateroscleroză spontană la papagalii Quaker.

Declarație de interese conflictuale
Autorii nu au declarat potențiale conflicte de interese în ceea ce privește cercetarea, autorul și/sau publicarea acestui articol.

Finanțarea
Autorii au dezvăluit primirea următorului sprijin financiar pentru cercetarea, autorul și/sau publicarea acestui articol: Acest studiu a fost finanțat de Kaytee Avian Foundation și de o subvenție VCS corp (LSU-SVM).