A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Claudia Asperti, Veronica Astro

caracterizarea

Divizia de afiliere a neuroștiințelor, Institutul Științific San Raffaele și Universitatea San Raffaele, Milano, Italia

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Claudia Asperti, Veronica Astro

Divizia de afiliere a neuroștiințelor, Institutul Științific San Raffaele și Universitatea San Raffaele, Milano, Italia

Divizia de afiliere a neuroștiințelor, Institutul Științific San Raffaele și Universitatea San Raffaele, Milano, Italia

Divizia de afiliere a neuroștiințelor, Institutul Științific San Raffaele și Universitatea San Raffaele, Milano, Italia

Divizia de afiliere genetică și biologie celulară, Institutul Științific San Raffaele, Milano, Italia

Divizia de afiliere a neuroștiințelor, Institutul Științific San Raffaele și Universitatea San Raffaele, Milano, Italia

  • Claudia Asperti,
  • Veronica Astro,
  • Emanuela Pettinato,
  • Simona Paris,
  • Angela Bachi,
  • Ivan de Curtis

Cifre

Abstract

Citare: Asperti C, Astro V, Pettinato E, Paris S, Bachi A, de Curtis I (2011) Caracterizarea biochimică și funcțională a interacțiunii dintre Liprin-α1 și GIT1: Implicații pentru reglarea motilității celulare. PLOS ONE 6 (6): e20757. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020757

Editor: Maddy Parsons, Kings College Londra, Regatul Unit

Primit: 27 ianuarie 2011; Admis: 9 mai 2011; Publicat: 13 iunie 2011

Finanțarea: Următoarele surse de finanțare către Ivan de Curtis au susținut această lucrare: AIRC, Asociația Italiană pentru Cercetarea Cancerului, grant n.10321 (http://www.airc.it/) Fondazione Cariplo (http://www.fondazionecariplo.it /portal/sv1.do) Telethon - Italia, acordați GGP09078 (http://www.telethon.it/). Mai mult, o bursă de la FIRC, Fundația Italiană pentru Cercetarea Cancerului (http://www.fondazionefirc.it/) a sprijinit-o pe Veronica Astro. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Migrația celulară necesită evenimente moleculare complexe care trebuie să fie reglate fin în timp și spațiu [1]. GIT1 (proteina G-cuplată cu receptorul kinazei care interacționează cu proteina 1) și GIT2/PKL formează o familie de proteine ​​ArfGAP multi-domeniu cu activitate de schelă, care sunt implicate în reglarea aderenței și migrării celulelor pe matricea extracelulară [2]. Aceștia interacționează printr-un SHD (domeniul de omologie Spa2) cu componentele familiei PIX (factor de schimb care interacționează kinaza activată p21) a factorilor de schimb de nucleotide de guanină pentru GTPaze Rac și Cdc42 [3] - [5]. Mai mult, regiunea carboxi-terminală a proteinelor GIT poate interacționa cu proteinele adaptor paxilina [6], [7] și liprin-α1 [8], ambele implicate în formarea și rotația FA (aderențe focale) mediate de integrină [9] ] - [11].

Proteinele GIT sunt implicate în diferite căi care reglează motilitatea celulară. De exemplu, GIT1 este implicat în migrarea celulelor musculare netede vasculare dependente de EGF [12], în timp ce al doilea membru al familiei, GIT2 este un jucător cheie pentru direcționalitatea chimiotactică în neutrofilele stimulate [13] și este necesar pentru direcționalul dependent de PDGF migrația celulară și polaritatea celulei, dar nu pentru migrarea aleatorie [14].

S-a propus că GIT1 poate circula între cel puțin trei compartimente subcelulare distincte, inclusiv FA, marginea de vârf și compartimente citoplasmatice, iar interacțiunea funcțională dintre GIT1, βPIX și PAK a fost asociată cu activitatea protrusivă și migrarea celulelor [15], [ 16]. Pe de altă parte, funcția precisă a complexelor GIT în motilitatea celulară este încă insuficient înțeleasă, iar constatările existente au condus la rapoarte contradictorii cu privire la faptul dacă recrutarea complexelor mediate de GIT afectează pozitiv [17] sau negativ [18] influențează medierea Rac proeminență.

Localizarea GIT1 la marginea anterioară poate juca un rol în recrutarea activatorului GTPase βPIX și a efectorului Rac PAK în aceeași locație, restrângând astfel activitatea Rac1 în fața celulelor mobile unde este necesară asamblarea actinei [19] - [ 21]. S-a demonstrat că GIT1 reglează activitatea proeminență la limita celulei și că complexul GIT1/PIX/PAK este recrutat de către proteina FA paxilină la structuri adezive periferice dinamice pentru a regla rotația acestora [17].

Liprinele sunt o familie de proteine ​​de schelă care includ subfamilii liprin-α și -β [10]. Proteinele liprin-α sunt proteine ​​multi-domeniu care pot interacționa direct cu mai mulți parteneri de legare. Lucrări recente au arătat că liprin-α1 este un regulator esențial al motilității celulare și al invaziei celulare tumorale [11], [22] - [24], dar implicația exactă și rolul diferitelor complexe liprin-α/partener în reglarea celulei motilitatea este slab înțeleasă [25]. Am arătat că interacțiunea GIT1 cu liprin-α1 și paxilină trebuie reglată. De fapt, atât liprina-α1, cât și paxilina interacționează slab cu proteina GIT1 de lungime totală, în timp ce interacționează eficient cu fragmente carboxi-terminale de GIT1 sau cu polipeptide GIT1 cu deleții interne limitate [26], sugerând că funcția GIT1 este reglată de o intramoleculară. mecanism. În consecință, supraexprimarea proteinei GIT1-C trunchiate „active”, dar nu a proteinei de lungime totală, duce la o răspândire celulară îmbunătățită [26].

În acest studiu am analizat interacțiunea biochimică și funcțională dintre liprin-α1 și GIT1 pentru a explora rolul acestei interacțiuni în motilitatea celulară. Prin experimente de co-imunoprecipitare am arătat că GIT1 poate forma complexe alternative fie cu paxilină, fie cu liprin-α1. Mai mult, am constatat că GIT1 este necesar pentru răspândirea și migrarea celulelor mediate de liprină-α1, deși interacțiunea directă dintre cele două proteine ​​nu pare a fi esențială pentru aceste procese. În cele din urmă, am demonstrat un efect reciproc al liprinei și GIT asupra localizării lor la FA la marginea celulei, care s-a corelat cu capacitatea celor două proteine ​​de a interacționa între ele.

Rezultate si discutii

Liprin-α1 interferează cu legarea paxilinei, dar nu a βPIX la GIT1

Paxilina interacționează cu regiunea carboxi-terminală a șobolanului GIT1 incluzând reziduurile 640-770 (reziduurile 610-740 la puiul GIT1) prin motivele LD [7], [28]. Așa cum era de așteptat, paxilina endogenă a co-precipitat cu FLAG-GIT1 (512-740) care include regiunea de legare completă a paxilinei [7] (Fig. S1, E). Pe de altă parte, construcțiile care includ ștergeri scurte la carboxi-terminal [FLAG-GIT1 (229-680) și FLAG-GIT1 (229-667)] au abolit interacțiunea atât cu liprina-α1, cât și cu paxilina (Fig. S1, C- D). În ansamblu, rezultatele arată că o regiune extinsă a porțiunii carboxi-terminale a GIT1 este necesară pentru interacțiunea eficientă cu liprina-α1 și că regiunea GIT1 necesară pentru legarea la liprina-α1 include regiunea de legare a paxilinei.

GIT1 și βPIX formează hetero-complexe stabile în celulele COS7 [26]. Am testat astfel dacă legarea βPIX la domeniul SHD al GIT1 a interferat cu legarea liprinei-α1 la carboxi-terminalul GIT1 adiacent. Am folosit co-imunoprecipitarea din lizatele celulare transfectate pentru a testa posibila interferență între liprină-α1 și legarea βPIX de GIT1. Celulele COS7 co-transfectate cu HA-GIT1-C2 și HA-βPIX, cu HA-GIT1-C2 și FLAG-Liprin-α1, sau triple-transfectate cu HA-GIT1-C2, HA-βPIX și FLAG-Liprin-α1 au fost imunoprecipitat cu anticorpi anti-FLAG. Cantități similare de GIT1-C2 au fost co-imunoprecipitate cu anticorpi anti-liprin-α1 în prezența sau absența βPIX, indicând faptul că legarea liprinei-α1 la GIT1-C2 nu a afectat interacțiunea GIT1-C2 cu βPIX (Fig. 1, B). Aceste rezultate indică faptul că GIT1 poate fi găsit în complex atât cu βPIX, cât și cu liprin-α1 în același timp. Pe de altă parte, am constatat că imunoprecipitarea βPIX din celulele co-transfectate a dus la co-precipitarea eficientă a GIT1-C2 atât în ​​prezența, cât și în absența liprinei-α1 (Fig. 1, C). Aceste rezultate arată că un complex trimeric βPIX/GIT1/Liprin-α1 se poate forma în celulă.

Am arătat anterior că legarea paxilinei la complexele GIT1/βPIX endogene sau supraexprimate este de obicei nedetectabilă și necesită activarea GIT1 prin mecanisme necunoscute. La fel, liprina-α1 interacționează slab cu GIT1 de lungime completă, în timp ce interacționează eficient cu mutanții de ștergere GIT1 care imită o formă activată de GIT1 [26]. În ceea ce privește paxilina, nu am putut detecta interacțiunea liprinei endogene cu complexele endogene GIT/PIX după imunoprecipitare din lizatele COS7 (Fig. 1, D). Mai mult, așa cum s-a arătat deja pentru paxilină, coexprimarea βPIX nu a îmbunătățit asocierea liprin-α1 supraexprimată cu GIT1 cu lungime totală supraexprimată (Fig. 1, E). Prin urmare, putem concluziona că legarea βPIX la GIT1 nu este suficientă pentru a activa legarea acestor liganzi la porțiunea carboxi-terminală a GIT1.

GIT1 este necesar pentru răspândirea eficientă a celulelor mediate de liprină-α1

(A) Supraexpresia liprinei-α1 afectează localizarea GIT endogen la FA periferice. Celulele COS7 care supraexprimă fie FLAG-liprin-α1, fie FLAG-βgalactozidază au fost placate timp de 1 oră pe FN și imunizate pentru proteina transfectată și pentru GIT endogen. Bara de scalare, 20 µm. Panoul din dreapta: mărirea de patru ori a câmpului în cutie; supraexprimarea liprinei-α1 (celulă cu asterisc) reduce acumularea de GIT la FA nou formate la marginea celulelor transfectate (vârfuri de săgeți). Bara de scalare, 5 µm. (B) Celulele transfectate cu FLAG-βgalactozidază, FLAG-liprin-α1 sau FLAG-liprin-ΔCC3 au fost placate timp de 1 oră pe FN înainte de fixare și colorare pentru proteina transfectată și pentru proteine ​​endogene GIT și FAK. Bara de scalare, 20 µm. (C) Mărirea mare a marginii celulelor transfectate care arată că GIT endogen se suprapune bine cu FAK la FA periferice ale celulelor transfectate FLAG-liprin-ΔCC3, în timp ce suprapunerea slabă între GIT endogen și FAK este văzută la FA periferice ale FLAG-liprin-α1 exprimând celule. Bara de scalare, 10 µm. Panourile din dreapta sunt măriri de 3 ori ale zonelor indicate de vârfuri de săgeată în imaginile corespunzătoare din stânga.

Dintre formele „activate” ale GIT1, am arătat că GIT1-C (Fig. S1, H, reziduuri de aminoacizi 346-740) a putut crește în mod specific răspândirea celulară și reorganizarea marginii celulei, în timp ce supraexprimarea proteina de lungime nu a prezentat efecte evidente asupra răspândirii în comparație cu celulele martor (Fig. 4, A - B). Similar cu ceea ce am observat după supraexprimarea liprin-α1, GIT1-C a indus pierderea de FA pozitive la paxilină din partea centrală a celulei de răspândire și concentrația de FA mici la paxilină pozitivă la marginea celulei (Fig. 4, A ). Pentru a examina în continuare interacțiunea dintre liprin-α1 și GIT1 în timpul răspândirii celulare, am testat efectele expresiei proteinei GIT1-C active trunchiate asupra localizării liprinei endogene-α1 la marginea celulei celulelor răspândite. Expresia GIT1-C, care poate lega fie paxilina, fie liprina-α1 (Fig. S1), a fost capabilă să sporească acumularea liprinei endogene-α1 la marginea celulei, unde liprina este parțial colocalizată cu FA-urile pozitive pentru paxilină ( Fig. S1). 4, C). Colocalizarea liprinei-α1 cu FA pozitive pentru paxilină a fost mult mai evidentă în celulele transfectate cu GIT1-C comparativ cu celulele martor.

(A) Celulele COS7 transfectate timp de o zi fie cu FLAG-GIT1, FLAG-GIT1-C sau FLAG-βGalactosidase au fost replacate timp de 1 oră pe FN. Imunofluorescența pentru proteinele transfectate (FLAG), paxilina și colorarea faloidinei pentru F-actină. Bara de scalare, 20 µm. Mai jos, sunt afișate măriri de 3 ori ale zonelor din celule colorate pentru paxilină (vârfuri de săgeți în celulele corespunzătoare de mai sus). (B) Exprimarea GIT1-C induce o creștere semnificativă a răspândirii celulare pe FN. Barele sunt mijloace ± SEM (n = 116-121 celule per afecțiune); * P Figura 5. GIT1 este necesar pentru migrarea celulei COS7 îmbunătățită cu liprină-α1.

(A) Celulele transfectate au fost reîncărcate pe 10 µg/ml FN timp de 50 min pentru a permite răspândirea și apoi au fost monitorizate pentru motilitate timp de 2,5 h, luând un cadru la fiecare 5 min. Panourile superioare prezintă urmele celulelor din celulele transfectate cu constructele indicate. Panoul inferior arată cuantificarea (valorile medii ± SEM) a diferiților parametri de migrație aleatorie, inclusiv urmele celulare (cale), distanța euclidiană (deplasare), rata de cale (Vp), rata euclidiană (Vd) și persistența migrației persista = cale/depl.). N = 18-20 celule per stare experimentală; * P 5'-GCCTGGATGGAGACCTAGA-3 'și 5'-AGCCAACCCCCAAGACAAATT -3' de maimuță verde umană GIT1, respectiv.

Cultura celulară și transfecție

Celulele COS7 și HeLa (din American Type Culture Collection, Teddington, Marea Britanie) au fost cultivate în mediul Eagle modificat de Dulbecco (Cambrex Bio Science Verviers SPRL, Charles City, IA) cu 10% ser. Celulele transfectate cu Lipofectamine 2000TM (Invitrogen) sau Fugene (Roche, Manheim, Germania) și 2-3 µg de plasmide sau siARN (50-100 nM) au fost utilizate după 1-2 zile, respectiv.

Imunoprecipitarea și imunoblotarea

Celulele au fost lizate cu 0,5-1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCI, 1 mM ortovanadat de sodiu, 10 mM fluorură de sodiu și inhibitori de protează. Alicote de 200-1.000 µg din fiecare lizat au fost incubate cu anticorpii indicați pre-legați de mărgele de proteină A-Sepharose (Amersham, Little Chalfont, Marea Britanie). Imunoprecipitarea paxilinei endogene a fost efectuată prin conjugarea de granule de proteină A Sepharose la 2 μl de Ig anti-șoarece de iepure (Sigma-Aldrich) și 1 μg de mAb anti-paxilină (BD Biosciences Transduction Laboratories). Pentru imunoblotarea anticorpilor primari au fost vizualizați prin ECL sau 125 I-anti-șoarece Ig sau Proteina A (Amersham).

Analiza spectroscopiei de masă

Bacteriile BL21 transformate cu pQE60ZZ-GIT1-C2 au fost utilizate pentru a exprima proteina de fuziune ZZ-GIT1-C2 la inducerea cu IPTG. Proteina de fuziune ZZ-GIT1-C2 include un fragment carboxi-terminal GIT1 legat de două domenii consecutive de legare IgG ale proteinei A. Bacteriile au fost lizate și proteina de fuziune a fost purificată pe perle IgG Sepharose 6 (Amersham). Pentru purificarea proteinelor care leagă ZZ-GIT1-C2, toate procedurile au fost efectuate la 0-4 ° C. 45 mg de proteină din lizatul creierului pui E12-E13 (tampon de liză: 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,1 mM DTT, 10 mM ortovanadat de sodiu, 1 mM fluorură de sodiu, anti- amestec de protează) au fost incubate cu ZZ-GIT1-C2 pre-absorbite la 75 pl de bile IgG. După incubare timp de 1,5 h cu rotație, granulele au fost spălate, transferate într-o coloană, spălate în continuare bine și eluate de două ori cu acid acetic 0,5 M (pH 3,4). Probele de control au inclus mărgele de IgG Sepharose incubate cu lizat cerebral (în absența proteinei ZZ-GIT1-C2) și margele de IgG Sepharose acoperite cu proteină ZZ-GIT1-C2 (în absența lizatului cerebral). O pătrime din fiecare eluat și din mărgelele rămase după eluare cu acid acetic au fost analizate prin SDS-PAGE pe geluri de acrilamidă 6%.

Pentru identificarea proteinelor, benzile de interes au fost excizate din gelurile SDS - PAGE colorate cu argint, reduse, alchilate și digerate peste noapte cu tripsină bovină, așa cum este descris în altă parte [40]. Unul dintre supernatantele digestiei a fost utilizat pentru analiza spectrometrului de masă în timp MALDI (TOF MS) folosind tehnica picăturilor uscate și acidul α-ciano-4-hidroxicinamic ca matrice. Toate analizele au fost efectuate folosind un TOF MS Voyager-DE STR (Applied Biosystems) operat în modul de extracție întârziată. Peptidele au fost măsurate în intervalul de masă de la 750 la 4.000 Da; toate spectrele au fost calibrate și procesate intern prin intermediul software-ului Data Explorer. Proteinele au fost identificate fără ambiguitate prin căutarea unei baze de date cuprinzătoare de proteine ​​non-redundante utilizând programul ProFound [41].

Testele de răspândire celulară