ABSTRACT

Rv1106c (hsd; 3β-hidroxisteroid dehidrogenază) este necesară de Mycobacterium tuberculosis pentru creșterea colesterolului ca singură sursă de carbon, în timp ce Rv3409c nu este. Mutația Rv1106c nu reduce creșterea Mycobacterium tuberculosis la macrofagele infectate sau la cobai. Concluzionăm că colesterolul nu este necesar ca sursă nutrițională în timpul infecției.

esențială

Mycobacterium tuberculosis este un actinomicet nocardioform și este o bacterie intracelulară facultativă care infectează de obicei macrofagele gazdă. M. tuberculoza a evoluat împreună cu oamenii și persistă în ciuda acțiunilor sistemului imunitar. Supraviețuirea M. tuberculosis necesită adaptare la micro-mediu gazdă (14). În mediul intracelular, M. tuberculosis trece de la un metabolism pe bază de carbohidrați la unul pe bază de acizi grași (3, 15, 21), iar în cultură, M. tuberculosis va crește pe colesterol ca singură sursă de carbon (18). Un rol al colesterolului în mediul intracelular ar putea fi ca sursă de carbon, de exemplu, catabolism în acetat și propionat (5, 24, 25). În plus, colesterolul poate servi ca element de bază pentru structuri complexe, de exemplu, lipide și hormoni prin anabolism.

Prin profilarea transcripțională (16, 24), analiza bioinformatică și analiza metabolică a altor actinomicete (9), a fost schițată o cale metabolică parțială pentru metabolismul colesterolului în M. tuberculosis. Primul pas este conversia colesterolului în cholest-4-en-3-one (17) (Fig. 1). În Streptomyces spp. și Rhodococcus equi, această etapă este catalizată de colesterol oxidaze, care împărtășesc 60% identitate de aminoacizi și au structuri și mecanisme aproape identice (13, 20). Cel mai apropiat omolog al M. tuberculosis, Rv3409c, împărtășește doar 24% identitate de aminoacizi cu colesterolul oxidazele bine caracterizate din Streptomyces și Rhodococcus. Deși s-a raportat că lizatele celulare Mycobacterium smegmatis care supraexprimă Rv3409c conțin activitate de colesterol oxidază, caracterizarea enzimei purificate nu a fost raportată (4).

Reacția catalizată de M. tuberculosis 3β-hidroxisteroid dehidrogenază (HSD).

Nocardia spp. (10, 12), proteobacteriile (7) și cel mai probabil Rhodococcus jostii (19) utilizează o 3β-hidroxisteroid dehidrogenază pentru a cataliza conversia colesterolului în cholest-4-en-3-one. În M. tuberculosis, Rv1106c (hsd) este cel mai apropiat omolog (75% identitate cu enzima Nocardia, UniProtKB ID Q03704). Într-adevăr, am demonstrat în lucrările anterioare că Rv1106c codifică o 3β-hidroxisteroid dehidrogenază (HSD) funcțională care poate utiliza colesterol, pregnenolonă și dehidroepiandosteron ca substraturi (26). Aici, investigăm esențialitatea acestor gene pentru creșterea M. tuberculosis in vitro și in vivo.

În primul rând, am testat dacă creșterea in vitro cu colesterolul ca sursă de carbon necesită fie Rv3409c, fie hsd. (Protocoale experimentale detaliate pot fi găsite în materialul suplimentar.) Am constatat că hsd este necesar pentru creșterea colesterolului ca sursă unică de carbon în cultura bulionului, în timp ce mutantul Rv3409c a crescut la fel ca și tipul sălbatic (Fig. 2). Pentru a confirma în continuare neesențialitatea Rv3409c pentru creșterea colesterolului, am testat un mutant transposon M. smegmatis Rv3409c (myc11) (22) pentru creșterea colesterolului ca singură sursă de carbon pe plăcile de agar. Mutantul myc11 a format colonii la fel de ușor ca tulpina mc 2 155 de tip sălbatic (datele nu sunt prezentate).

Hsd, dar nu Rv3409c, este necesar pentru creșterea colesterolului ca singură sursă de carbon. Tulpinile au fost cultivate în mediu 7H9 conținând 1 mg ml -1 colesterol (în tiloxapol) la 37 ° C. Datele reprezintă rezultatele fiecărui experiment derulat în duplicat.

Complementarea mutantului hsd cu gena de tip sălbatic și 1.000 de baze în amonte de cadrul deschis de citire (26) a restabilit complet creșterea colesterolului (Fig. 2). Toate tulpinile au crescut în mod normal în mediu standard 7H9 suplimentat cu glicerol și 10% complex de albumină-dextroză-NaCl (ADN) (date neprezentate). Concluzionăm că hsd, dar nu Rv3409c, este necesar pentru creșterea colesterolului ca singură sursă de carbon.

Anterior, am demonstrat că hsd este necesar pentru activitatea de oxidare a colesterolului în lizatele celulare (26). Pentru a investiga dacă hsd este necesară pentru oxidarea 3β-hidroxisterolului în celulele intacte, tulpinile au fost cultivate în mediu standard (mediu lichid 7H9 [Becton Dickinson], suplimentat cu 0,05% Tween 80, ADN [1] și 0,2% glicerol). După ce celulele au atins faza log, s-a adăugat 0,2 μCi de colesterol [4-14 C]. La cinci ore după adăugarea colesterolului, lipidele au fost extrase (2) și analizate prin cromatografie lichidă cu numărare scintilație și detectare UV. Analiza celulelor de tip sălbatic a arătat că> 99% din colesterolul [14 C] a fost consumat în decurs de 5 ore (Fig. 3 A). În același timp, cantități mari de colesterol [14 C] (> 40% din numărul total) au rămas în mutantul hsd (Fig. 3A).

Hsd este necesar pentru conversia colesterolului în cholest-4-en-3-one de către M. tuberculosis. Rezultatele analizei UV prin cromatografie lichidă de înaltă performanță, spectrometrie de masă, sunt prezentate pentru mutantul de tip sălbatic, hsd și hsd completat. (A) M. tuberculoza a fost incubată timp de 5 ore cu colesterol [4-14 C] și analizată prin numărare scintilație și absorbție UV. Cpm reflectă echilibrul relativ de masă dintre probe. (B) M. tuberculoza a fost incubată timp de 5 ore cu colesterol. Se arată profilul cromatografic UV de la 3,6 la 3,9 minute (porțiune umbrită în panoul A). Intensitățile absorbantei nu reflectă echilibrul relativ de masă dintre probe, care au fost concentrate în diferite măsuri pentru analiză. Pentru profilul complet și analiza spectrală de masă, vezi Fig. S1 și S2 în materialul suplimentar.

Apoi, a fost evaluat rolul hsd în creșterea M. tuberculosis în macrofage. Culturile de tip sălbatic și mutante au fost utilizate pentru a infecta celulele THP-1 care au fost făcute să se diferențieze în celule asemănătoare macrofagelor cu 40 nM 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetat (PMA) (23). Nu a fost detectată nicio diferență în rata de creștere intracelulară (vezi Fig. S5 în materialul suplimentar). Prin urmare, întreruperea hsd nu limitează replicarea M. tuberculosis în macrofag.

Cobaiii infectați cu M. tuberculoza dezvoltă granuloame similare cu cele observate în boala umană. Prin urmare, modelul de cobai a fost utilizat pentru a evalua rolul in vivo al hsd. Rata de creștere in vivo, greutatea pulmonară, morfologia pulmonară și histologia pulmonară au fost determinate pe o perioadă de 6 săptămâni. Nu a fost observată nicio reducere a creșterii la tulpina mutantă (Fig. 4). Numărul de granuloame din plămânii animalelor infectate de mutantul hsd și tulpina completată părea a fi mai mare decât în ​​tipul sălbatic (Fig. 4B și C). Această diferență poate fi rezultatul unor răspunsuri imune diferite. Indiferent, gena hsd nu este necesară pentru creșterea sau supraviețuirea M. tuberculosis la cobai. Mai mult, dacă acumularea de colesterol în mutantul hsd are loc în timpul infecției, așa cum se întâmplă in vitro, nivelul ridicat de colesterol nu este toxic pentru bacterie. Acest rezultat este în contrast cu toxicitatea metaboliților acumulați, care se observă la întreruperea genelor care codifică enzimele care metabolizează inelul ulterior în calea colesterolului M. tuberculosis (6, 17, 25).

Mutația hsd nu afectează formarea granulomului în modelul de infecție al cobaiului. Paisprezece cobai au fost infectați cu ∼102 CFU/plămân din fiecare tulpină M. tuberculosis. La momentele indicate, au fost sacrificate patru până la șase cobai pe tulpină, iar plămânii au fost cântăriți, o porțiune a fost excizată pentru histologie, iar restul a fost omogenizată pentru titrarea CFU. (A) Ratele de creștere a M. tuberculozei în plămânii cobaiilor infectați cu aerosoli. Barele de eroare sunt abaterile standard. (B) Patologia brută a plămânilor la 42 de zile după infecție. (C) Histopatologia plămânilor prezentată în panoul B.

În concluzie, am stabilit că 3β-hidroxisteroidul dehidrogenază codificată de Rv1106c (hsd) este necesară pentru creșterea colesterolului ca singură sursă de carbon, în timp ce colesterolul oxidativ putativ, Rv3409c, nu este. Experimentele de lipidomică au arătat că sursele de carbon lipidic ramificate cu metil de la gazdă sunt sursa primară de nutriție in vivo pentru M. tuberculosis (11, 27). Observația noastră că hsd nu este necesară pentru creșterea macrofagelor activate sau a modelului de cobai al infecției cu M. tuberculosis sugerează că colesterolul nu este o singură sursă de nutriție in vivo. Mai mult decât atât, fadA5, adnotat provizoriu ca codificând o enzimă de scindare a lanțului lateral, este necesar pentru metabolismul colesterolului și creșterea colesterolului ca singură sursă de carbon in vitro. Deși FadA5 nu este necesar pentru creșterea M. tuberculosis la șoareci, este necesar pentru întreținerea gazdei (16). Aceste observații combinate sugerează că M. tuberculosis nu se bazează pe colesterol ca singură sursă de energie în gazdă. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu disponibilitatea mai multor surse de energie lipidică în gazdă și cu munca recentă a lui Rhee și a colegilor săi care demonstrează că M. tuberculosis cocatabolizează mai multe surse de carbon (8).

ADDENDUM ÎN DOCUVARE

Garcia și colegii săi au raportat recent că M. smegmatis Rv3409c nu este necesar pentru mineralizarea colesterolului (I. Uhia, B. Galán, V. Morales și JK García, Environ. Microbiol., Doi: 10.1111/j.1462-2920.2010.02398x, 2011).

MULȚUMIRI

Recunoaștem sprijinul financiar de la National Institutes of Health (AI065251 la NSS, HL53306 la NSS, AI085349 la NSS, A1044856 la IS, AI065987 la IS și NIH/NIAID NO1-AI30036 [contract TARGET]) și la New York State Technology and Program de cercetare (FDP C040076, către NSS).

Mulțumim lui P. Chou pentru munca sa cu privire la investigațiile inițiale ale Rv3409c și J.-M. Reyrat pentru că a oferit mutantul myc11.