Abstract

O dietă bogată în grăsimi (HFD) și starea supraponderală pot induce disfuncții hipocampice, ducând la depresie și anxietate. Exercițiile fizice au efecte benefice asupra comportamentelor emoționale. Am raportat anterior că antrenamentul de exerciții fizice salvează expresia excesului hipocampic neuronal de oxid nitric sintază (NNOS) indusă de HFD, care este un regulator cheie al anxietății. Aici, am investigat comportamentele asemănătoare anxietății și expresia nNOS hipocampală ca răspuns la HFD combinat cu exercițiul. Șoarecii au fost repartizați la dieta standard, HFD sau HFD cu grupuri de exerciții timp de 12 săptămâni. Am constatat că exercițiul în ultimele 6 săptămâni ale regimului HFD a îmbunătățit 12 săptămâni de defecație indusă de HFD, însoțit de salvarea expresiei nNOS în exces. Cu toate acestea, indicatorii de anxietate din labirintul ridicat plus au rămas neschimbați. Aceste efecte nu au fost evidente după doar o săptămână de exercițiu. În concluzie, 6 săptămâni de antrenament a redus anxietatea legată de HFD conform uneia dintre măsurile noastre (defecație) și a inversat modificările căii nNOS/NO a hipocampului.

Introducere

Prevalența globală a obezității, un factor important care contribuie la povara bolilor, crește rapid. Consumul excesiv de grăsime crește riscul de supraponderalitate și obezitate, care au fost asociate cu tulburări mentale [1, 2]. Studiile epidemiologice au arătat că atât consumul unei diete occidentale, cât și starea supraponderală sunt asociate cu un volum mai mic de hipocamp [3, 4] și cu tulburări mentale, cum ar fi anxietatea [2, 5]. Cu toate acestea, după cum sa afirmat de Eyres și colab., Nu există dovezi puternice ale efectului benefic al pierderii în greutate induse de dietă asupra anxietății la persoanele cu obezitate [6]. Prin urmare, se pare că sunt necesare intervenții suplimentare, nu numai pentru ameliorarea obezității, ci și a simptomelor anxietății la persoanele obeze.

Materiale și metode

Animale

Optzeci de șoareci masculi C57BL/6 J (4 săptămâni; Japonia SLC, Shizuoka, Japonia) au fost găzduiți la o temperatură (23,5 ± 0,7 ° C), umiditate (34,0 ± 5,7%) și lumină (ciclu de 12 ore lumină - întuneric) ) instalație controlată. Animalele au primit chow și apă standard ad libitum. Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Fukuoka.

HFD și antrenament la exerciții

Protocolul HFD și de antrenament la exerciții au fost descrise anterior [21]. Pe scurt, după 2 săptămâni de aclimatizare, șoarecii au fost împărțiți în trei grupe: grupul de dietă standard (SD) (n = 24) a fost hrănită cu o dietă standard (CE-7, CLEA Japonia, Tokyo, Japonia; 62% carbohidrați, 14% grăsimi și 25% proteine), grupul HFD (n = 28) a fost hrănit cu un HFD (HFD-32, CLEA Japonia, Tokyo, Japonia; 23% carbohidrați, 57% grăsimi și 20% proteine) și HFD + Exn = 28) grupul a fost alimentat cu HFD-32 pentru perioada experimentală de 12 săptămâni și i s-a permis să se exercite voluntar într-o roată de rulare pentru ultimele 6 săptămâni ale experimentului. Atât grupurile HFD, cât și cele HFD + Ex au fost crescute în cuști cu o roată de rulare, dar numai grupului HFD + Ex i s-a permis accesul gratuit la roata de rulare în ultimele 6 săptămâni ale experimentului. Greutatea corporală și numărul de rotații ale roților au fost măsurate în fiecare a doua zi. Distanța totală de rulare a fost calculată pe baza numărului de rotații a roții. Am efectuat teste comportamentale 2 (n = 6/grup), 6n = 6-7/grup), 7 (1 săptămână de antrenament, n = 6-7/grup) și 12 săptămâni (6 săptămâni de antrenament, n = 6-7/grup) în sesiunea experimentală și apoi a sacrificat șoarecii prin decapitare (Fig. 1).

anxietății

Vedere schematică a experimentului. Acest proiect de studiu a fost modificat față de studiul nostru anterior [21]. Șoarecii HFD au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi pe parcursul perioadei experimentale de 12 săptămâni. Șoarecii HFD + Ex au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi pe parcursul perioadei experimentale de 12 săptămâni și li s-a oferit acces voluntar la o roată de rulare de la vârsta de 12 săptămâni până la sfârșitul experimentului. Șoarecii au efectuat teste comportamentale la 2, 6, 7 și 12 săptămâni. La trei zile după testele comportamentale, șoarecii au fost uciși prin decapitare

Testarea comportamentului

Am evaluat comportamentele asemănătoare anxietății folosind labirintul crescut plus (EPM), cu 3 zile înainte de sacrificiu (Fig. 1). Toate testele au fost efectuate între 13:00 și 16:00 în perioada de lumină (80-100 lx). Înainte de fiecare test, aparatul de testare a fost curățat temeinic cu 70% (v/v) etanol și uscat pentru a reduce prezența indicilor olfactivi.

Am efectuat testul EPM conform protocolului lui Nishijima și colab. [22]. Pe scurt, labirintul consta din patru brațe (fiecare 30 cm lungime și 5 cm lățime) la 40 cm deasupra podelei. Două brațe conțineau pereți laterali și de capăt care aveau 15 cm înălțime (brațe închise), iar celelalte două brațe nu aveau pereți (brațe deschise). Am înregistrat comportamentul mouse-ului printr-o cameră video. Șoarecii au fost așezați în centrul labirintului astfel încât să se confrunte cu un braț deschis și au fost lăsați să exploreze timp de 5 minute. Următorii parametri au fost măsurați manual: (1) numărul de intrări în brațul deschis; (2) numărul total de intrări de braț (total de intrări de braț = intrări de braț deschis + intrări de braț închis, ori); (3) procentul de intrări de braț deschis (intrări de braț deschis/total de intrări de braț × 100); (4) defecație (ori).

Pregătirea țesuturilor

La trei zile după EPM, șoarecii au fost sacrificați prin decapitare după 6 ore de post. Hipocampul a fost rapid colectat și omogenizat folosind pensete pentru a evita specificitatea regiunii. Apoi, porțiuni de țesut hipocampic au fost înghețate în azot lichid pentru analiza proteinelor. Pentru analiza expresiei genice, o porțiune de țesut hipocampic a fost imersată rapid în soluție de stabilizare a ARN-ului (Ambion, Austin, TX). Toate exemplarele au fost depozitate la - 80 ° C pentru analiza biochimică ulterioară.

Analiza Western blot

Expresia genelor

Nivelurile de expresie a genei nNOS au fost determinate așa cum s-a descris anterior [21]. Țesutul hipocampic de la șoareci SD, HFD și HFD + Ex a fost omogenizat utilizând un omogenizator Polytron. ARN total a fost extras din toate probele folosind sistemul Maxwell® 16 LEV (Promega, Tokyo, Japonia). Am efectuat un test RT-PCR în timp real cu sistemul PCR în timp real Step One (Applied Biosystems) folosind sonde TaqMan Gene Expression Assay pentru a analiza nivelurile de ARNm nNOS (Nr. 1-Mm00435175_m1; Applied Biosystems, Foster City, CA). Nivelurile de ARNm nNOS au fost normalizate la nivelurile de ARNm GAPDH (Gapdh-Mm99999915_g1; Applied Biosystems) și cuantificat folosind metoda ΔΔCt.

Statistici

Datele sunt prezentate ca valori medii ± SE. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind versiunea prisma 7.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Am folosit Student’s t-teste pentru a evalua parametrii comportamentali, nivelurile de proteine ​​și expresia genelor la 2 și 6 săptămâni (SD și HFD). Datele non-parametrice au fost evaluate folosind Mann-Whitney U Test. Am folosit un ANOVA unidirecțional, urmat de testul post hoc al lui Bonferroni, pentru a efectua comparații de grup pentru parametrii comportamentali, nivelurile de proteine ​​și expresia genelor la 7 și 12 săptămâni (SD, HFD și HFD + Ex). Datele non-parametrice au fost evaluate folosind testul Kruskal - Wallis. Corelațiile au fost calculate utilizând corelațiile produs-moment ale lui Pearson. A P valoare

Rezultate

Efectul HFD și exercițiul asupra greutății corporale și a grăsimii la 2, 6, 7 și 12 săptămâni

Consumul de HFD a dus la o creștere rapidă a greutății corporale și a masei de grăsime viscerală cu 2 săptămâni (Fig. 2a, b). Această creștere a greutății corporale și a masei de grăsime la șoarecii HFD a continuat la 6, 7 și 12 săptămâni, comparativ cu șoarecii SD (P FIG. 2

Efectul HFD asupra comportamentelor asemănătoare anxietății și a căii nNOS/NO la 2 săptămâni

După 2 săptămâni de consum de HFD, am observat modificări ale comportamentului asemănător anxietății în EPM (Fig. 3). Am găsit diferențe semnificative în numărul de intrări cu braț deschis (P FIG. 3

Proteina nNOS hipocampală, expresia genelor și nivelurile de fosforilare au fost neschimbate prin consumul de HFD la 2 săptămâni (Fig. 3e-i). Nivelurile pAkt Ser473 au crescut semnificativ, iar nivelurile ser133 ale CREB și pCREB au scăzut la șoarecii HFD (Fig. 3j, l, m).

Efectul HFD asupra comportamentelor asemănătoare anxietății și a căii nNOS/NO la 6 săptămâni

La 6 săptămâni, nu am găsit diferențe semnificative în niciun parametru testat, inclusiv intrările de braț deschis (Fig. 4a), intrările de braț total (Fig. 4b), procentul de intrări de braț deschis pe intrările de braț total (Fig. 4c) și defecare (Fig. 4d) între șoareci SD și HFD. Deși 6 săptămâni de consum de HFD nu au afectat expresia proteinei hipocampice nNOS sau alte molecule legate de nNOS/NO, nivelurile de expresie a genei nNOS au fost semnificativ crescute (Fig. 4e - m).

Efectul HFD și 1 săptămână de exercițiu asupra comportamentelor asemănătoare anxietății și calea nNOS/NO la 7 săptămâni

Deși nu este semnificativ statistic, în comparație cu grupul SD, numărul total de intrări de braț a scăzut în grupul HFD la 7 săptămâni (P = 0,07, FIG. 5b). Procentul de intrări ale brațului deschis pe intrările totale ale brațului a scăzut semnificativ la șoarecii HFD + Ex (Fig. 5c). Am observat defecarea în grupurile SD și HFD, dar nu și în grupul HFD + Ex. Cu toate acestea, nu am găsit diferențe semnificative între grupuri (Fig. 5d). Aceste rezultate sugerează că parametrii comportamentali măsurați au fost parțial afectați de consumul de HFD, dar nu de exerciții. La 7 săptămâni, nivelurile de expresie nNOS ale hipocampului au crescut semnificativ la șoarecii HFD (P Nivelurile Ser1412/GAPDH și pAkt Ser473 au crescut odată cu consumul de HFD și au scăzut odată cu exercițiul (Fig. 5g, j). Nivelurile pCREB Ser133 au fost neschimbate în toate grupurile (Fig. 5l).

Efectul HFD și 6 săptămâni de exercițiu asupra comportamentelor asemănătoare anxietății și a căii nNOS/NO la 12 săptămâni

La momentul final (Fig. 6, 12 săptămâni de consum de HFD cu 6 săptămâni de antrenament), intrările brațului deschis și procentul de intrări ale brațului deschis pe intrările totale ale brațului au fost similare în grupurile HFD și SD (Fig. 6a, c). Cu toate acestea, procentul de intrări de braț deschis pe total de intrări de braț (P Ser1412 și AktSer473 par să fi fost neschimbate de consumul și exercițiile de HFD (Fig. 6g, h, j). Fosforilarea CREB Ser133 la șoareci HFD + Ex a fost semnificativ mai mare decât cea la șoareci HFD (Fig. 6l). Aceste rezultate indică faptul că 6 săptămâni de efort în timpul consumului de HFD îmbunătățesc comportamentele asemănătoare anxietății prin modularea căii hipocampice nNOS/NO.

Relația dintre nivelurile de expresie a proteinei hipocampice nNOS și greutatea corporală sau masa de grăsime viscerală

Apoi, am explorat posibili factori care contribuie la modificările observate ale nivelurilor de expresie a proteinei hipocampice nNOS. La 2 și 6 săptămâni, nivelurile de expresie nNOS nu au fost asociate cu greutatea corporală sau masa de grăsime viscerală (Fig. 7a, b, e, f). Cu toate acestea, la 7 săptămâni, nivelurile de expresie nNOS au fost semnificativ corelate cu greutatea corporală (r = 0,59, P FIG. 7

Corelația dintre nivelurile de expresie a proteinei hipocampice nNOS și greutatea corporală (A, b, c, și d) și masa relativă de grăsime viscerală (e, f, g, h) la 2 săptămâni (A, e), 6 saptamanib, f), 7 săptămânic, g) și 12 săptămânid, h). Cercuri deschise, grup SD; cercuri gri deschis, grup HFD; cercuri gri închise, grup HFD + Ex. Liniile din graficele scatter prezintă corelații semnificative (prin testul de corelație produs-moment al lui Pearson)

Discuţie

Principalele constatări ale acestui studiu au fost: (1) consumul de HFD a crescut nivelurile de exprimare a proteinei hipocampice nNOS; (2) antrenamentul de exerciții a inversat modificările expresiei nNOS hipocampice și a redus anxietatea legată de HFD în conformitate cu una dintre cele două măsuri; și (3) expresia nNOS a hipocampului a fost corelată cu greutatea grăsimii/greutatea corporală la 7 și 12 săptămâni.

Două săptămâni de consum HFD au scăzut semnificativ intrările de braț deschis și procentul de intrări de braț deschis/total. Cu toate acestea, nivelurile de expresie nNOS ale hipocampului au fost neschimbate la 2 săptămâni de consum de HFD. Mai mult, 6 săptămâni de consum de HFD nu par să modifice parametrii comportamentali măsurați sau nivelurile de expresie nNOS ale hipocampului. În concordanță cu rezultatele noastre, Gainey și colab. [23] a raportat că HFD a fost asociat cu comportamente crescute de anxietate la 3 săptămâni de consum de HFD, dar nu 1 sau 6 săptămâni. Un alt studiu a arătat că consumul de HFD a fost asociat cu o scădere a timpului petrecut în brațele deschise ale testului EPM la 1 săptămână, dar nu la 3 săptămâni [24]. Prin urmare, se pare că anxietatea tranzitorie a fost indusă în timpul etapelor inițiale ale consumului de HFD, deși mecanismele care stau la baza acestui fenomen sunt încă neclare. Descoperirea noastră că expresia nNOS hipocampală a crescut odată cu durata perioadei experimentale indică faptul că mecanismele de reglare a stării de spirit induse de obezitate prin calea nNOS/NO diferă între etapele timpurii și cele târzii ale obezității.

În concluzie, rezultatele noastre demonstrează că 7 și 12 săptămâni de consum de HFD au crescut nivelurile de expresie nNOS ale hipocampului. În plus, 6 săptămâni de antrenament fizic au restabilit expresia hipocampului nNOS și au îmbunătățit 12 săptămâni de anxietate legată de HFD în funcție de o recuperare a ratei defecației. Cu toate acestea, nu am găsit diferențe de anxietate măsurate de EPM. Mai mult, nivelurile de expresie nNOS ale hipocampului au fost asociate cu greutatea corporală și masa de grăsime viscerală în obezitatea indusă de HFD.

Referințe

Takase K, Tsuneoka Y, Oda S și colab. (2016) Hrănirea cu diete bogate în grăsimi modifică comportamentele olfactive, sociale și de recompensă ale șoarecilor independenți de obezitate. Obezitatea 24: 886–894

Jacka FN, Pasco JA, Mykletun A et al (2010) Asociația dietelor occidentale și tradiționale cu depresie și anxietate la femei. Am J Psychiatry 167: 305-311