Consumul pe termen lung de dietă bogată în grăsimi afectează coordonarea motorie fără a afecta activitatea motorie generală

Clinica Mayo, Departamentul de Neurologie, 200 First St. SW, Rochester, MN 55905, SUA.

consumul

Claudio A Mastronardi

Școala de Medicină și Științe ale Sănătății, Universidad Del Rosario, Bogota, Columbia.

Grupul de cercetare Neuroscience (NEUROS), Universitatea Rosario, Bogota, Columbia.

Colegiul de Medicină, Universitatea de Stat din New York Universitatea de Medicină Nord-statică, Syracuse, NY, SUA.

Departamentul de Psihiatrie, Universitatea de Stat din New York Upstate Medical University, Syracuse, NY, SUA.

Mind and Brain Theme, South Australia Health and Medical Research Institute, Adelaide, Australia .

Departamentul de Psihiatrie, Colegiul de Medicină și Sănătate Publică, Universitatea Flinders, Bedford Park, Australia.

Departamentul de Psihiatrie, Universitatea de Stat din New York Upstate Medical University, Syracuse, NY, SUA.

Abstract

Cuvinte cheie

coordonare motorie, bogat în grăsimi, neuron dopaminergic, microglia, diabet

Abrevieri:

ABC: complex avidin-biotină; AEEC: Comitetul de etică al experimentării animalelor la Universitatea Națională Australiană; SNC: sistemul nervos central; DA: dopamină; DAB: 3,3`-diaminobenzidină; GTT: test de toleranță la glucoză intraperitoneală; i.p.: intraperitoneal; IL-1: interleukină-1; IL-1R1: receptor 1 IL-1; IL-1ra -/-: eliminarea antagonistului receptorului IL-1; IL-1џџ: IL-1 beta; IL-10 ±: IL-1 alfa; LPS: lipopolizaharidă; PBS: soluție salină tamponată cu fosfat; PD: boala Parkinson; rpm: rotații pe minut; SEM: eroare standard a mediei; SN: substantia nigra; SNpc: substantia nigra pars compacta; SNpr: substantia nigra pars reticulata; TH: tirozinhidroxilază; VTA: zona tegmentală ventrală; WT: de tip sălbatic

Introducere

Materiale și metode

Animale

Șoarecii masculi C57bl/6 în vârstă de șase săptămâni (10 per grup experimental) au fost adăpostiți în grupuri de până la cinci indivizi pe cușcă și au fost menținuți în condiții de viață standard (22 +/- 2ºC, 12/12 ore ciclu lumină/întuneric, hrană și apă ad libitum). Aceste condiții au rămas consistente pe tot parcursul experimentului, cu excepția cazului în care se indică altfel. Șoarecii au fost hrăniți fie cu HFD, fie cu RD timp de 15 luni. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu regulile și reglementările „Codului de practică australian pentru îngrijirea și utilizarea animalelor în scopuri științifice”. Toate protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul de etică pentru experimentarea animalelor din cadrul Universității Naționale Australiene (AEEC).

Hrănire

Șoarecilor masculi în vârstă de șase săptămâni li s-a permis accesul gratuit fie la HFD (18,6% din conținutul de grăsimi și 44,3% carbohidrați furnizați din Specialty Feed (Australia, numărul pisicii: SF10-020); această dietă este echivalentă cu dieta Harlan Teklad, numărul pisicii: TD.95217) sau RD (4,8% din conținutul de grăsimi și 59,4% carbohidrați furnizați din hrana specială (Australia, numărul pisicii: SF10-020).

Teste comportamentale

Testele de comportament au fost efectuate de la vârsta de 8 săptămâni (de două ori pe lună) și până la vârsta de 12 luni.

Test în câmp deschis: Abilitățile de locomoție, coordonare și echilibru au fost evaluate atunci când șoarecii erau tineri (42-45 de zile) și 9 luni mai târziu (adică când au devenit peste 10 luni). Locomoția a fost determinată prin plasarea fiecărui mouse individual într-o arenă în câmp deschis (48 cm x 48 cm) și înregistrarea activității sale timp de 32 de minute cu o cameră video plasată din partea de sus a arenei. Software-ul „Viewer 3” (Biobserve Gmbh, St. Augustin, Germania) a fost utilizat pentru colectarea și prelucrarea datelor, care a furnizat măsuri ale distanței totale parcurse.

Testul rețelei (testul de suspendare a celor patru membre): Testul grilei este utilizat pentru a evalua puterea membrelor șoarecilor [22, 23]. Acest test a fost utilizat ca test de control pentru a determina dacă diferențele observate în coordonarea motorie afișate de diferiți șoareci în testul rotarodului s-ar putea datora forței musculare reduse. Testul vizează determinarea capacității animalului de a prinde plasa de sârmă atât cu membrele anterioare, cât și cu membrele posterioare și să rămână agățată în pozițiile inversate pentru o perioadă de timp. Latența de scădere a fost înregistrată în câteva secunde și analizată. Șoarecii au primit trei studii, separate prin intervale intertribale de 5 minute. Înălțimea aparatului este cuprinsă între 20-50 cm pentru a împiedica că animalul să urce cu ușurință.

Testul polului: Acest test reprezintă una dintre metodele posibile utilizate pentru a evalua agilitatea animalelor. Este utilizat în principal ca măsurare a bradikineziei (încetinirea mișcării) [24]. Testul necesită utilizarea unui stâlp, cu înălțimea de 50 până la 55 cm și diametrul de 8 până la 10 mm, cu o suprafață aspră care se află vertical într-o cușcă de acasă. Testul a fost efectuat prin plasarea unui animal aproape de vârful stâlpului și lăsarea capului animalului în sus. Perioada de timp pe care animalul a petrecut-o întorcându-se (prima măsurătoare) și urcând în jos (a doua măsurare) a fost înregistrată. Prin urmare, ambii parametri (timpul de întoarcere și urcare în jos) au fost utilizați pentru evaluarea bradikineziei la șoareci.

Test pas cu pas: Testul pas cu pas este o altă metodă fiabilă de evaluare a akineziei anterioare [25]. Se efectuează pe o masă și animalul este așezat pe o margine a acesteia. Apoi, picioarele din spate sunt ridicate trăgând coada animalului în sus și în această poziție animalul este tras înapoi, către cealaltă margine a mesei, cu o lungime de 1 metru. Numărul de pași de reglare a animalelor de pe ambele picioare anterioare este numărat [25].

Test de strângere a membrelor posterioare: Acest test este utilizat pentru o evaluare a diskineziei (mișcări voluntare diminuate) la șoareci [26]. Șoarecii sunt suspendați în aer de coadă pentru o perioadă de zece secunde. Se observă și se punctează poziția membrelor posterioare. Pe baza poziției membrelor, șoarecii sunt punctați ca:

0- membrele posterioare sunt întinse spre exterior,

1- un membru posterior este retras spre abdomen,

2- ambele membre posterioare sunt parțial retrase spre abdomen și

3-membrele posterioare sunt complet retrase și ating abdomenul [27].

Testele metabolice

Aportul alimentar și măsurarea greutății corporale: Aportul alimentar a fost monitorizat o dată pe săptămână, timp de șapte luni. La sfârșitul fiecărei șapte zile, restul de mâncare din cușcă a fost ponderat și înregistrat. Aportul alimentar a fost exprimat ca o medie a greutății alimentelor (în kcal) per animal și normalizat în funcție de greutatea corporală a animalului (BW). Greutatea corporală a șoarecelui a fost măsurată săptămânal pe o perioadă de treisprezece luni. Șoarecii au fost cântăriți și greutatea lor corporală a fost înregistrată. Rezultatele finale au fost exprimate ca valoare medie a numărului total de animale/per grup. Spre sfârșitul experimentelor in vivo, compoziția corporală (procentul din masa grasă și greutatea masei slabe) a fost determinată prin scanare DEXA.

Scanare DEXA: Scanarea cu absorptiometrie cu raze X cu dublă emisie (DEXA) este utilizată în principal pentru a evalua densitatea minerală osoasă (DMO), compoziția corpului și conținutul de grăsime [28]. Înainte de testare, animalele sunt anesteziate profund cu 2-3% izofluoran-oxigen gazos pentru o perioadă întreagă de testare (5-10 minute) și apoi plasate într-un aparat PIXImus (PIXImus Mouse Densitometer). Întregul corp al fiecărui mouse a fost scanat și analizat cu software-ul PIXImus (LUNAR PIXImus 2). Capul mouse-ului a fost exclus din scanare utilizând ROI (regiunea de interes) care a fost plasată manual înconjurând întregul corp. Datele care au fost utilizate pentru analize suplimentare au fost: greutatea și procentul de masă grasă, greutatea țesutului slab.

Test de toleranță intraperitoneală la glucoză (IPGTT): Testul IPGTT este utilizat pentru a evalua cât de repede glucoza este eliminată din sânge la injectarea cu glucoză (i.p.). Înainte de testare, șoarecii au fost transferați în cuști curate și au postit pentru o perioadă de 6 ore, dar li s-a furnizat apă ad libitum. Șoarecii au fost cântăriți și nivelurile inițiale de glucoză din sânge au fost verificate prin colectarea unei picături mici de sânge din vena cozii animalului la 0 minut (valoarea inițială). Ulterior, șoarecii au fost injectați cu soluție de D-glucoză (2 g/kg, i.p.) [29], care a fost dizolvată anterior în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Nivelurile de glucoză au fost măsurate cu un glucometru (Accu Chek (R), Roche, Australia) la 30, 60, 90 și 120 de minute după injecție. La sfârșitul celor 14 luni de vârstă a șoarecilor, șoarecii au fost supuși testului de toleranță la glucoză intraperitoneală pentru a-și evalua toleranța la glucoză în funcție de tratamentul lor. Două luni mai târziu, șoarecii au fost eutanasiați și sângele lor colectat, iar nivelurile plasmatice de leptină și insulină au fost evaluate prin metoda ELISA.

Testul imunosorbent legat de enzime (ELISA): Sângele a fost colectat transcardic în tuburi acoperite cu acid etilendiaminetetraacetic (EDTA). Probele de sânge au fost centrifugate la 2000 g timp de 15 minute la 4 o C și plasma a fost separată de pânza de sânge și depozitată la -20 o C până la utilizare. Probele pentru măsurarea insulinei au fost diluate într-un raport de 1/8 pentru șoarecii alimentați cu HFD, în timp ce probele de RD nu au fost diluate. Insulina plasmatică a fost măsurată cu kitul ALPCO ELISA (Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA, număr de catalog: 80-INSMSU-E01, E10). Nivelurile de leptină au fost măsurate cu trusa ELISA de șoarece Leptin (DuoSet R&D Systems, număr de catalog: DY498). Probele pentru măsurarea leptinei au fost diluate într-un raport de 1/3 pentru șoarecii hrăniți cu RD și 1/8 pentru șoarecii hrăniți cu HFD.

Disecția țesuturilor adipoase: Țesutul adipos maro a fost izolat de aspectul dorsal al toracelui între scapule și colectat în tuburi ependorf pre-greutate, iar greutatea a fost măsurată după înghețarea în gheață uscată. Tampoanele de grăsime epididimale, retroperitoneale, viscerale și brune au fost izolate manual și ponderate.

Imunohistochimia neuronilor dopaminici și a celulelor microglia

Pregătirea țesuturilor: La cincisprezece luni de la inițierea experimentelor, șoarecii au fost anesteziați cu o injecție intraperitoneală de ketamină/xilazină (100/10 mg per kg, ajustat la un volum de 0,1 ml/10g greutate corporală) și perfuzați transcardial cu o soluție de rece soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și heparină (5 U/ml) în decurs de 3 minute. Creierul șoarecelui a fost îndepărtat și înghețat în izopentanol răcit și depozitat la -80 ° C până la utilizare. Creierele au fost tăiate folosind un criostat (setat la -12 ° C) în secțiuni coronale de 15 um pe întreg SN.

Cuantificarea neuronilor dopaminergici și a microgliei: Pentru a evalua pierderea neuronilor dopaminici și a numărului de celule microglia activate, au fost colectate două serii adiacente de 8 diapozitive consecutive (15 µm grosime) pentru a testa regiunea SN (rostral la caudal: -2,65 la -3,61 mm posterior bregma) [21]. Astfel, cele două serii de opt diapozitive uniform distanțate au fost obținute la fiecare 90 µm și au fost utilizate pentru numărarea neuronilor dopaminici sau a celulelor microglia activate. Limitele SN au fost definite pentru a exclude zona tegmentală ventrală (VTA) de la numărare [32]. Zona definită pentru numărare a acoperit întreaga zonă de la partea rostrală a SNpc până la capătul caudal al SN pars reticulata (SNpr), excluzând acei neuroni TH care s-au intercalat cu rădăcina nervului oculomotor. Imaginile au fost obținute cu o cameră digitală Olympus IX2-UCB (Olympus, Tokyo, Japonia) și analizate manual folosind software-ul ImageJ (http://imagej.nih.gov de la NIH). Celulele microglia CD68 pozitive din SN au fost numărate manual pe un microscop Nikon Eclipse 50i (Nikon, Tokyo, Japonia). Măririle imaginii au fost de 20x și 40x pentru microglia și 20x pentru TH.

analize statistice

Datele au fost analizate cu software-ul Graph-Pad versiunea 5 (GraphPad Software, La Jolla California SUA) și exprimate ca medie ± eroare standard a mediei (S.E.M). Diferențele dependente de timp în rezultatele comportamentale și metabolice au fost analizate prin testul T al Studentului nepereche și ANOVA cu două căi. Valorile informațiilor editoriale P

Redactor șef

Terry Lichtor
Tsuyoshi Hirata
Shinya Mizuno
Giacomo Corrado