Abstract

acizii grași (FA) sunt sursa dominantă de energie pentru inima mamiferelor adulte și sunt utilizați, de asemenea, pentru biosinteza membranei, generarea de molecule de semnalizare a lipidelor, modificarea proteinelor posttranslațională și reglarea transcripțională (43). Expunerea cronică la FA poate duce la un dezechilibru între absorbția FA și utilizarea care poate declanșa mecanisme citotoxice, ducând la disfuncție celulară sau la moarte, fenomen cunoscut sub numele de lipotoxicitate. Studii clinice și animale ample au arătat că acumularea excesivă de lipide în țesutul neadipos datorită FA crescută circulantă poate juca un rol important în afecțiuni fiziopatologice precum insuficiența cardiacă, obezitatea, rezistența la insulină și diabetul (15, 43, 58).

Acumularea crescută de lipide miocardice pare să fie asociată cu funcția contractilă miocardică afectată. Cu toate acestea, efectul acumulării crescute de lipide și a producției crescute de ceramide asupra funcției mitocondriale și efectele lor concomitente asupra funcției ventriculare în condiții fiziopatologice, cum ar fi insuficiența cardiacă, nu au fost evaluate sistematic. Acest studiu a fost conceput pentru a testa ipoteza că progresia insuficienței cardiace ar fi exacerbată de creșterea lipidelor miocardice și a unei inhibiții asociate induse de ceramidă a fosforilării oxidative mitocondriale (în special prin inhibarea activității complexului III). Ne-am testat ipoteza la șobolanii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi saturate după o intervenție chirurgicală de ligare a arterei coronare pentru a induce insuficiența cardiacă.

Proiectarea studiului și inducerea infarctului miocardic.

Acest studiu a fost realizat în conformitate cu Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, publicat de Institutul Național de Sănătate (publicația NIH nr. 85-23, revizuită în 1996) și a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Case Western Reserve University. Animalele au fost întreținute pe un ciclu invers 12-h: 12-h lumină-întuneric (adică luminile stinse la 6:00 AM) și toate procedurile și recoltele de țesuturi au fost efectuate în starea de post între 3 și 6 h în faza întunecată. a ciclului.

În proiectarea inițială a acestui studiu, șobolanii au fost hrăniți cu chow normal (10% calorii din grăsimi, 20% calorii din proteine ​​și 70% calorii din carbohidrați) sau o dietă bogată în grăsimi saturate [60% calorii din grăsimi (25% palmitic, 33% acid stearic și 33% acid oleic), 20% calorii din proteine ​​și 20% calorii din carbohidrați; Dietele de cercetare] pentru 2 săptămâni. Pentru inducerea insuficienței cardiace, șobolanii au fost anesteziați cu izofluran (1,5-2,0%), intubați și ventilați. Insuficiența cardiacă a fost indusă de ligarea arterei coronare principale stângi așa cum s-a descris anterior (1). Așa cum sa raportat în rezultate, a existat o mortalitate chirurgicală atât de marcată și semnificativă la șobolanii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi saturate înainte de intervenția chirurgicală de legare, încât proiectul studiului a fost modificat ulterior astfel încât toți șobolanii să rămână pe dieta normală înainte de intervenția chirurgicală de ligare. După inducerea insuficienței cardiace prin ligarea arterei coronare, șobolanii au fost repartizați aleatoriu fie unui grup de insuficiență cardiacă alimentat cu dietă normală (IC, n = 8) sau un grup de insuficiență cardiacă alimentat cu o dietă bogată în grăsimi saturate (HF + Sat, n = 7) timp de 8 săptămâni. Animale operate de rușine (fals; n = 8) au fost hrăniți cu o dietă normală.

Ecocardiografie.

Funcția VS a fost evaluată prin ecocardiografie înainte de ligarea arterei coronare și 8 săptămâni după ligarea arterei coronare utilizând un sistem Sequoia C256 (Siemens Medical) cu un traductor cu matrice liniară de 15 MHz, așa cum s-a descris anterior (36). Pe scurt, șobolanii au fost anesteziați cu 1,5-2,0% izofluran prin mască, pieptul a fost ras, animalul a fost situat în decubit dorsal pe un tampon de încălzire și au fost așezați electrozi pentru membrele ECG. Studiile ecocardiografice bidimensionale (2D), 2D ghidate în 2D și Doppler ale fluxurilor aortice și transmise au fost efectuate prin ferestre apicale parasternale și scurte. Dimensiunile end-diastolice și end-sistolice au fost măsurate utilizând software-ul rezident pe ultrasunograf. Indicele performanței miocardice și procentajul scurtării fracționare au fost calculate așa cum s-a descris anterior (36).

Măsurători hemodinamice.

La opt săptămâni după ligarea arterei coronare, a fost efectuată o procedură chirurgicală terminală pentru a evalua presiunea VS și proprietățile contractile. Șobolanii au fost anesteziați (1,5-2,0% izofluran), intubați și ventilați. Un cateter cu traductor de presiune microtip (3,5 Fr, Instruments Millar) a fost introdus prin artera carotidă dreaptă în LV. Măsurători ale ritmului cardiac, ale vârfului presiunii sistolice VS și ale ratei maxime a creșterii și scăderii presiunii VS (± dP/dt) au fost înregistrate pe o perioadă de 30 s folosind un Digi-Med Heart Performance Analyzer-τ.

Pregătirea mitocondriilor.

În urma canulării VS, probele de sânge au fost extrase din vena cavă inferioară. VS, ventriculul drept și masa cicatricială au fost obținute prin măsurători gravimetrice. O probă de țesut miocardic (~ 100 mg) a fost recoltată și imediat congelată rapid. Cicatricea și echilibrul VS au fost plasate în KME (100 mM KCl, 50 mM MOPS, sare internă și 0,5 mM EGTA). Subcarcolemele cardiace (SSM) și mitocondriile interfibrilare (IFM) au fost izolate folosind procedura lui Palmer și colab. (38) cu excepția faptului că s-a folosit un tampon Chappell-Perry modificat (conținând 100 mM KCl, 50 mM MOPS, 1 mM EGTA, 5 mM MgSO4 · 7H2O și 1 mM ATP, pH 7,4 la 4 ° C) pentru izolarea ambelor mitocondriale populații. IFM au fost recoltate după tratamentul fibrelor jupuite cu 5 mg/g greutate umedă de tripsină timp de 10 minute la 4 ° C (35). Concentrația de proteine ​​mitocondriale a fost determinată prin metoda Lowry folosind albumina serică bovină ca standard.

Fosforilarea oxidativă mitocondrială.

Activitate complexă ETC mitocondrială.

Probele de SSM și IFM (10 mg colat/1 mg proteină mitocondrială) au fost amestecate în 1 ml tampon [75 mM manitol, 220 mM zaharoză, 2 mM EDTA și 5 mM MOPS (pH 7,4)] cu cocktail de inhibitor al proteazei mamiferelor (1) μl/1 ml tampon) și au fost ținute pe gheață. Testele au fost finalizate în ziua pregătirii.

Detectarea producției de H2O2.

Produse metabolice plasmatice și tisulare.

Conținutul de C16-ceramidă în VS a fost măsurat printr-o procedură de cromatografie a gazelor capilare cu un detector de ionizare cu flacără folosind C17-ceramidă ca standard intern, așa cum s-a descris anterior (51). Conținutul de țesut TG a fost măsurat în extracte omogenizate utilizând o metodă de spectrofotometru enzimatic (Wako Chemicals, Richmond, VA). Acizii grași fără plasmă și TG au fost măsurați utilizând un set de spectrofotometrie enzimatice disponibile în comerț (39). Concentrațiile plasmatice ale insulinei și leptinei au fost testate prin test imunologic ELISA (ALPCO Diagnostics, Salem, NH).

Microscopie electronică.

SSM și IFM proaspăt izolate au fost pregătite pentru microscopie electronică de transmisie așa cum s-a descris anterior (16).

analize statistice.

Diferențele dintre grupurile simulate, HF și HF + Sat au fost determinate utilizând o analiză unidirecțională a varianței urmată de Bonferroni t-teste pentru comparații multiple. Datele sunt exprimate ca mijloace de grup ± SE. Pentru toate analizele statistice, semnificația a fost acceptată la P 2 -analiza). Având în vedere rata de mortalitate semnificativ mai mare la animalele hrănite cu dietă cu grăsimi saturate înainte de ligarea arterei coronare comparativ cu cele hrănite cu dieta normală, grupul care a hrănit o dietă bogată în grăsimi saturate înainte ca ligarea arterelor coronare a fost ulterior eliminat din studiu din cauza unei „părtiniri supraviețuitoare” în acest grup de animale.

Masa corpului și a inimii.

Hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi saturate a fost inițiată imediat după ligarea arterei coronare, a crescut masa corporală în comparație cu simularea și IC (Tabelul 1). Masa totală LV (masa LV + masa țesutului cicatricial) a fost crescută în HF + Sat în comparație cu simularea; cu toate acestea, când s-a normalizat la greutatea corporală (masa totală a VS/masa corporală), nu au existat diferențe între grupuri. Masa medie a țesutului cicatricial nu a diferit între cele două grupuri ligate (HF și HF + Sat).

tabelul 1. Masa corpului și a inimii în fals, HF și HF + Sat 8 săptămâni după intervenția chirurgicală de ligare a arterei coronare

Valorile sunt medii ± SE. Sham, animalele acționate de shamn = 8); IC, grupul cu insuficiență cardiacă a alimentat o dietă normală (n = 8); HF + Sat; grupul cu insuficiență cardiacă a alimentat o dietă bogată în grăsimi saturate (n = 7); VS, ventricular stâng.

* PP

îmbunătățește

FIG. 1.Hemodinamica ventricularului stâng (VS) și măsurători ecocardiografice în grupul acționat de fals (fals; n = 8), grupul cu insuficiență cardiacă a alimentat o dietă normală (IC; n = 8), iar grupul cu insuficiență cardiacă a alimentat o dietă bogată în grăsimi saturate (HF + Sat; n = 7). Rata de vârf a creșterii și scăderii presiunii BT (± dP/dt) măsurătorile au fost obținute de la un traductor de presiune Millar. Măsurătorile ecocardiografice, incluzând dimensiunile end-diastolice și sistolice finale, procentul de scurtare fracționată și indicele de performanță miocardic, au fost obținute din vederi parasternale cu ax lung și scurt. Valorile sunt medii ± SE. *P

Substraturi metabolice: acizi grași liberi, TG, ceramidă, leptină și insulină.

Acizii grași fără plasmă nu au fost modificați prin insuficiență cardiacă sau hrănire bogată în grăsimi (Tabelul 2). TG plasmatic (Tabelul 2) și TG țesutului miocardic (Fig. 2) au fost crescute în HF + Sat comparativ cu falsul și HF. În mod similar, conținutul de C16-ceramidă al țesutului miocardic a fost crescut în HF + Sat în comparație cu sham și HF (Fig. 2). Conținutul de C16-ceramidă a fost, de asemenea, măsurat în SSM și IFM; cu toate acestea, la 33% din probele de SSM și 84% din probele de IFM, conținutul de ceramidă a fost sub nivelul de detectare prin cromatografie gazoasă. Leptina plasmatică a fost crescută în HF + Sat în comparație cu sham și HF (Tabelul 2). Nivelurile de insulină din plasmă nu au fost diferite (Tabelul 2).

FIG. 2.Conținutul de trigliceride ale țesutului miocardic și conținutul de C16-ceramidă în țesut, HF și HF + Sat. Valorile sunt medii ± SE. *P

masa 2. Acizi grași fără plasmă, trigliceride, leptină și insulină în sham, HF și HF + Sat 8 săptămâni după operația de ligare a arterei coronare

Valorile sunt medii ± SE.

* PP

FIG. 3.Compararea morfologică a mitocondriilor subsarcolemale (SSM) și interfibrilare (IFM) în simulări, HF și HF + Sat prin microscopie electronică. Linia de scară, stânga sus, care se aplică tuturor micrografiilor, este egal cu 1 μm.

Fosforilarea oxidativă.

Randamentul proteic în SSM și IFM nu a fost modificat de insuficiența cardiacă sau de alimentarea cu grăsimi saturate ridicate (Tabelul 3). Recuperarea mitocondrială în timpul protocolului de izolare, de asemenea, nu a diferit între grupuri. Respirația de stat 3 nu a fost modificată de insuficiența cardiacă folosind glutamat, DHQ sau TMPD-ascorbat ca substraturi respiratorii. Cu toate acestea, odată cu utilizarea glutamatului și a DHQ, acesta a fost crescut în ambele populații mitocondriale de HF + Sat (Tabelul 3).

Tabelul 3. Randamentul proteinelor și ratele de fosforilare oxidativă mitocondrială în SSM și IFM de Sham, HF și HF + Sat 8 săptămâni după intervenția chirurgicală de ligare a arterei coronare

Valorile sunt medii ± SE. Frecvențele respiratorii sunt exprimate ca nAO · min −1 · mg −1. SSM și IFM, mitocondrii subsarcolemale și, respectiv, interfibrilare; DHQ, durohidroquinonă; TMPD, N,N,N′,N′ -Tetrametil-p-fenilendiamina.

Tabelul 4. Activități enzimatice complexe ale lanțului de transport de electroni și mitocondriale în SSM și IFM ale simulării, HF și HF + Sat 8 săptămâni după intervenția chirurgicală de ligare a arterei coronare

Valorile sunt medii ± SE. Activitățile complexe ale lanțului de transport al electronilor și ale activităților enzimatice sunt exprimate ca nmol · min −1 · mg proteină mitocondrială −1, cu excepția complexului IV, care este exprimat ca constantă a ratei de ordinul I (k, 1 · min −1 · mg proteină −1). Q, coenzima Q.

* PPP = 0,058 vs. fals și HF.

Activitatea citratului sintază a fost crescută în SSM în HF + Sat comparativ cu HF (Tabelul 4). Activitatea crescută nu s-a datorat unei creșteri a conținutului de proteine ​​mitocondriale și nu a dus la creșteri mai mari ale respirației de starea 3 (relativ la IFM), ci poate reflecta pur și simplu răspunsuri diferențiale ale SSM și IFM în stările bolnave, după cum sa raportat anterior (30) . Aconitaza a fost crescută în HF + Sat în comparație cu sham și HF în SSM și în HF + Sat în comparație cu HF în IFM (Tabelul 4). O pierdere sau scădere a activității aconitazei mitocondriale este un indicator intracelular al deteriorării oxidative. Astfel, activitatea crescută a aconitazei în SSM și IFM indică o capacitate antioxidantă crescută, care este în concordanță cu lipsa creșterii producției de H2O2 (vezi mai jos).

Producția de H2O2.

Producția de H2O2 în prezența rotenonei nu s-a modificat în SSM (673 ± 98, 677 ± 118 și 817 ± 76 pmol · mg proteină -1,30 min -1) sau IFM (658 ± 102, 719 ± 190 și 735 ± 55) de sham, HF și respectiv HF + Sat. Producția maximă de H2O2 în prezența antimicinei A a fost nealterată de insuficiența cardiacă sau de alimentarea cu grăsimi saturate. Inhibarea producției maxime de H2O2 de către stigmatelină a fost similară în toate grupurile.

Principala constatare a acestui studiu este că administrarea unei diete bogate în grăsimi saturate într-un model de insuficiență cardiacă indusă de ligarea arterei coronare a crescut fosforilarea oxidativă mitocondrială și activitățile complexe ETC. În plus, administrarea unei diete bogate în grăsimi saturate nu a afectat negativ funcția contractilă a VS sau progresia remodelării VS. În ciuda creșterii ceramidei miocardice, nu au existat dovezi ale unui efect lipotoxic asupra funcției contractile sau mitocondriale.

O altă explicație potențială pentru absența lipotoxicității în această investigație este acțiunea antilipolitică a leptinei. S-a sugerat că rolul fiziologic principal al leptinei este acela de a preveni acumularea de FA în țesuturile neadipoze, cum ar fi mușchiul scheletic, ficatul, pancreasul și inima (52). La șoarecii cu cardiomiopatie lipotoxică severă, indusă transgenic de supraexprimarea specifică cardiomiocitelor a acil-CoA sintază, creșterile nivelurilor plasmatice de leptină au prevenit complet cardiomiopatia dilatată, creșterea depozitelor de TG miocardic și hipertrofia cardiomiocitară (27). În mod similar, în timpul obezității induse de dietă, hiperleptinemia a protejat nonadipocitele de steatoză și lipotoxicitate (28). Este important de reținut, totuși, că nivelurile plasmatice de leptină raportate în aceste studii depășesc cu mult nivelurile raportate în grupul nostru HF + Sat. Astfel, absența lipotoxicității în grupul nostru cu insuficiență cardiacă alimentată cu o dietă bogată în grăsimi saturate poate fi parțial explicată de creșterea leptinei plasmatice care poate acționa într-un mod cardioprotector.

Compoziția FA poate juca, de asemenea, un rol în funcția mitocondrială datorită efectelor diferențiale ale grăsimilor saturate față de cele nesaturate. Studiile anterioare efectuate in vitro au arătat clar că FA saturate cu lanț lung sunt implicate în căile lipotoxice care duc la cardiomiopatie, în timp ce FA mono-și polinesaturate nu sunt (32, 46). În aceste studii, sa demonstrat că palmitatul saturat cu lanț lung induce apoptoză, citocrom c eliberarea, activarea caspazei și scara ADN, toți markerii morții celulare. Cu toate acestea, FA saturată stimulează, de asemenea, oxidarea mitocondrială la șobolani, în timp ce FA mononesaturată nu a avut niciun efect (14). În mod similar, FA nesaturate sunt asociate cu o lipoperoxidare mai mare (8), decuplarea mitocondrială și producția de specii reactive de oxigen (7) în comparație cu FA saturată. Astfel, sunt necesare studii suplimentare pentru a elucida mecanismele responsabile de aceste efecte diferențiale ale FA saturate și nesaturate, în special în ceea ce privește efectul lor asupra respirației mitocondriale și a activităților complexe ETC.

În rezumat, în ciuda sugestiilor anterioare privind o legătură directă între intermediarii lipotoxici și disfuncția contractilă a VS, rezultatele noastre arată în mod clar că alimentarea cu grăsimi saturate ridicate după ligarea arterei coronare nu a exacerbat disfuncția și remodelarea VS, la momentul examinat. Mai mult, administrarea unei diete bogate în grăsimi saturate într-un model de insuficiență cardiacă indusă de ligatură a crescut fosforilarea oxidativă mitocondrială și activitățile complexe ETC. Absența unui efect lipotoxic coincident cu creșteri ale ceramidei miocardice a fost un rezultat neașteptat al acestui studiu care justifică investigații suplimentare. Studiile viitoare ar trebui să examineze, de asemenea, dacă efectele hrănirii cu conținut ridicat de grăsimi saturate asupra funcției contractile miocardice și mitocondriale sunt observate în condiții de control și nu sunt unice pentru modelele de leziuni, cum ar fi insuficiența cardiacă indusă de ligare sau în etapele ulterioare ale progresului insuficienței cardiace.

Această lucrare a fost susținută de Asociația Americană a Inimii-Biroul Național, Grantul pentru Dezvoltare a Științificului 0535361N (către MP Chandler) și Institutul Național de Inimă, Plămâni și Sânge Granturi HL-081857 (către MP Chandler) și PO1-HL-074237 (către CL Hoppel ).

NOTĂ DE PICIOASĂ

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, articolul trebuie marcat prin prezenta „publicitate”În conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

Mulțumim cu recunoștință Dr. Bernard Tandler de la Școala de Medicină Dentară, Case Western Reserve University, pentru asistență editorială și Rachel Floyd de la Louis Stokes Veteran Affairs Research Center pentru asistență în pregătirea figurii de microscopie electronică. Autorii îi mulțumesc, de asemenea, lui Hazel Huang pentru asistență în analiza biochimică.