Klara Kostovtsikova

1 Laborator de imunologie celulară și moleculară, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

dieta

2 Laborator de biologie celulară și de dezvoltare, Institutul de genetică moleculară a CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Stepan Coufal

1 Laborator de imunologie celulară și moleculară, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Natalie Galanova

1 Laborator de imunologie celulară și moleculară, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Alena Fajstova

1 Laborator de imunologie celulară și moleculară, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Tomas Hudcovic

3 Laboratorul de gnotobiologie, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Nový Hrádek, Cehia

Martin Kostovcik

4 Laborator de genetică fungică și metabolizare, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Petra Prochazkova

1 Laborator de imunologie celulară și moleculară, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Zuzana Jiraskova Zakostelska

1 Laborator de imunologie celulară și moleculară, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Martina Cermakova

5 Laboratorul de caracterizare a structurii moleculare, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Blanka Sediva

5 Laboratorul de caracterizare a structurii moleculare, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

6 Facultatea de Științe Aplicate, Universitatea din Boemia de Vest, Pilsen, Cehia

Marek Kuzma

5 Laboratorul de caracterizare a structurii moleculare, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Helena Tlaskalova-Hogenova

1 Laborator de imunologie celulară și moleculară, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Miloslav Kverka

1 Laborator de imunologie celulară și moleculară, Institutul de Microbiologie al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

7 Departamentul de farmacologie, Institutul de Medicină Experimentală al CAS, v.v.i., Praga, Cehia

Date asociate

Abstract

Introducere

Microbiota intestinală comensală influențează semnificativ metabolismul gazdei. Căile sale catabolice și anabolice îi permit să utilizeze un spectru larg de substraturi, inclusiv elemente ingerate, substanțe secretate în lumenul intestinal sau cele produse direct de (alți) microbi (1). Dintre aceste surse, dieta reprezintă cea mai mare parte a volumului și, deoarece este cea mai ușor de influențat, intervenția dietetică a microbiotei și a sănătății atrage cea mai mare atenție. Modificările din dieta stimulează microbii pentru a se adapta la un nou substrat, inducând astfel schimbări profunde ale microbiotei care ar putea îmbunătăți capacitatea gazdei de a se adapta la mediu. Modificările induse de extremele dietetice pot persista o lungă perioadă de timp și astfel reflectă dieta gazdei (2). Aceste modificări adaptive sunt similare între diferite linii de mamifere și au implicații importante pentru sănătatea gazdei (3). Intervențiile dietetice pot induce, de asemenea, modificări rapide și reproductibile ale microbiotei și pot îmbogăți comunitatea cu microbi tranzitorii de origine alimentară, care nu sunt capabili de colonizare pe termen lung (4). Într-adevăr,

15% din unitățile taxonomice operaționale microbiene (OTU) prezintă fluctuații diurne puternice din cauza momentului de administrare a alimentelor sincronizând astfel ceasul circadian până la nivelul proceselor metabolice. Interesant este faptul că încălcarea pe termen lung a acestui sistem reglat fin în rândul lucrătorilor în schimburi și al celor care circulă frecvent poate provoca disbioză temporală cu consecințe metabolice grave (5).

Întreruperea microbiotei intestinale, și anume, disbioza, a fost recent legată de patogeneza bolii inflamatorii intestinale (IBD) (6), a sindromului metabolic (7, 8), a bolilor cardiovasculare (9), a tulburărilor neurologice (10) și chiar a cancerului 11 ). Există un număr tot mai mare de dovezi că macronutrienții dietetici pot promova sau contracara disbioza și consecințele acesteia (12). Atât intervențiile dietetice pe termen scurt, cât și pe termen lung conduc la modificări substanțiale ale microbiotei intestinale și pot influența starea pro-inflamatorie a mucoasei intestinale (13, 14). Există o legătură bine recunoscută între dietă și IBD. Studiile retrospective au constatat că aportul ridicat de zaharoză, carne roșie sau margarină crește riscul relativ pentru IBD, consumul de cereale, fructe și legume sau alimente bogate în fibre, în general, scade (15-18).

Aportul alimentar crescut de proteine ​​animale a fost propus ca factor care contribuie la dezvoltarea bolii Crohn de câteva decenii în urmă (19, 20). Metabolismul proteinelor are loc în principal în colonul distal, unde sursele pe bază de carbohidrați sunt reduse, iar bacteriile își pot schimba metabolismul la unul asacarolitic. În funcție de sursa proteinei, proteinele animale și jurnalul sunt aproape complet degradate în timpul trecerii, în timp ce proteinele vegetale sunt mai puțin degradate și ajung în intestinul gros în cantități mai mari (21). Degradarea proteinelor, peptidelor și aminoacizilor duce la producerea diferiților metaboliți biologic activi, cum ar fi acizi grași cu lanț ramificat, amoniu, hidrogen sulfurat, p-crezol, derivați fenolici și indolici, care ar putea influența viabilitatea și proliferarea celulelor epiteliale, astfel afectând funcția de barieră intestinală și răspunsul imun. Unele dintre aceste activități au fost legate de patogeneza IBD și a altor boli gastrointestinale (22).

Mai multe studii au analizat efectul dietei bogate în proteine ​​(HPD) asupra fiziologiei gastrointestinale și a răspunsului epitelial de bază. Șobolanii care consumă HPD au avut o compoziție microbiotică și o activitate metabolică diferită, au modificat morfologia colonocitelor și căile enzimatice, au crescut mai multe celule calice și au crescut producția de mucină în comparație cu șobolanii care consumă dietă normoproteică (23-25). Inducerea inflamației experimentale la șoarecii hrăniți cu HPD a dus la colită severă cu mortalitate ridicată (26). Recent, un studiu care a analizat sursa și cantitatea de macronutrienți a constatat că o cantitate mare de cazeină alimentară contribuie cel mai semnificativ la sensibilitatea colitei, în timp ce sensibilitatea la fibre de psyllium scade. În ambele cazuri, compoziția microbiotei și funcțiile de densitate și barieră intestinală au fost principalele mecanisme implicate (27). Luate împreună, aceste studii au arătat că diverse proteine ​​dietetice pot schimba răspunsul gazdei la microbiota intestinală, inclusiv reglarea fină a sistemului imunitar al mucoasei și, în cele din urmă, influențează susceptibilitatea la colita experimentală.

Produsele metabolismului microbiotei intestinale (cum ar fi acizii grași cu lanț scurt, SCFA) influențează maturarea și activitatea celulelor T și pot regla sistemul imunitar al gazdei atât direct, cât și indirect prin intermediul altor celule (28, 29). Prin atașarea la epiteliul intestinal, microbii pot regla echilibrul în răspunsul celulelor T intestinale. În funcție de microbul particular, acestea pot induce fie celule T reglatoare, fie celule Th17 pro-inflamatorii (30, 31). În ambele cazuri, celulele mononucleare din mucoasa intestinală joacă un rol crucial în răspunsul imun al mucoasei și în sensibilitatea la inflamația intestinală. De fapt, celulele mononucleare, cum ar fi macrofagele care locuiesc în mucoasa intestinală, contribuie la toleranța locală și la mediul neinflamator, producând IL-10 și PGE2 și nu răspunzând la lipopolizaharida bacteriană (32). Întrucât, monocitele de sânge Ly6C + sunt recrutate în mucoasă ca răspuns la stimularea pro-inflamatorie; depășind numărul macrofagelor rezidente și producând cantități mari de IL-1β și TNF-α (33, 34).

Scopul acestui studiu a fost de a analiza modul în care proteinele dietetice pot contribui la patogeneza IBD, cu accent special pe mecanismele microbiene și imunologice folosind două seturi (pe bază de proteine ​​animale și vegetale) de diete normo și hiper-proteice complet sintetice. Experimentele gnotobiotice au fost folosite pentru a descifra importanța interacțiunii gazdă-dietă-microbiotă și consecințele acesteia pentru inflamația intestinală acută.

Materiale și metode

Animale

Șoarecii BALB/c imuno-competenți și șoarecii knock-out RAG2 imuno-deficienți pe fundal BALB/c au fost obținuți din colonia de reproducere a Institutului de Fiziologie al CAS și, respectiv, a Institutului de Microbiologie al CAS, și toate experimentele au fost efectuate în cadrul oricărui condiții convenționale sau fără germeni la Institutul de Microbiologie al CAS. Șoarecii au fost hrăniți cu dietă de întreținere pentru șobolani și șoareci Nr. 1324 (Altromin Spezialfutter, GmbH & Co. KG, Germania), dacă nu se specifică altfel. Diferite grupuri experimentale au fost adăpostite în cuști separate. În plus, șoarecii fără germeni au fost adăpostiți în izolatoare din plastic de tip Trexler în condiții sterile, furnizate cu apă sterilă timp de câteva generații înainte de începerea experimentelor. Acest studiu a fost realizat în conformitate cu recomandările standardelor de etică definite de legislația UE privind utilizarea animalelor experimentale (2010/63/UE) și de legea cehă privind bunăstarea animalelor. Protocolul a fost aprobat de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor al Institutului de Microbiologie (ID aprobare: 85/2015 și 108/2016).

Dietele și proiectarea experimentală

În majoritatea experimentelor, la scurt timp după înțărcare, șoarecii au fost trecuți fie pe dieta bazată pe proteine ​​animale - control (DCA, 176 g/kg proteină brută; Cat # C1000), cât și pe cea bogată în proteine ​​(aHPD, 514 g/kg proteină brută; Cat # C1001) sau dietă pe bază de proteine ​​vegetale - control (pCD, 173 g/kg proteină brută; Cat # C 1000/110007) și dietă bogată în proteine ​​(pHPD, 500 g/kg proteină brută; Cat # C1001/1001127; toate de la Altromin Spezialfutter, GmbH & Co. KG). Toate aceste diete au fost preparate sintetic, conținând fie cazeină (animal), fie gluten de grâu (plantă) ca sursă de proteină (Tabelul 1). Șoarecii au fost menținuți pe aceste diete timp de 3 săptămâni înainte de începerea experimentului și apoi pe parcursul întregului experiment. În unele experimente, efectul pe termen lung al dietei a fost analizat prin trecerea dietei deja la generația parentală a șoarecilor. Am măsurat permeabilitatea intestinală pentru macromolecule la șoareci sănătoși hrăniți cu diete diferite. În acest scop, am tratat șoarecii pe cale orală cu 440 mg/kg din greutatea corporală a moleculei dextran marcate cu FITC de 3-5 kD (Merck, Cat # FD4) și am măsurat fluorescența serică 4 ore mai târziu, după cum am publicat anterior (35).

tabelul 1

Compoziția dietelor experimentale.

aCDaHPDpCDpHPD
Proteine ​​[g/kg]176,115th cel mai frecvent514.115Cea mai frecventă 172.685500.440
Grăsimi [g/kg]50.830 e cel mai frecvent51.030 e cel mai frecvent70.937 e cel mai frecvent70.002 cea mai frecventă
Fibre [g/kg]40.450 e cel mai frecvent39.370 e cel mai frecvent30.358th cel mai frecvent30.490 este cel mai frecvent
Cenușă [g/kg]Cel mai frecvent 54.943Cel mai frecvent 63.34353.10051.522 e cel mai frecvent
Umiditate [g/kg]Cel mai frecvent 81.736Cel mai frecvent 77.73676.874 e cel mai frecvent71.076
Mono și dizaharide [g/kg]110.960110.960Cel mai frecvent 110.65056.806 cea mai frecventă
Polizaharide [g/kg]471.700115.700422.425116.147 cel mai frecvent
Energie [kcal/kg]3518.0553458.0553641.5663669.700

Colită experimentală acută și cronică

Colita cronică DSS a fost indusă de trei cicluri constând în 5 zile DSS și 9 zile apă de la robinet. Analizele severității colitei prin DAI, scurtarea colonului și afectarea mucoasei au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus. Nivelul de haptoglobină proteică în fază acută a fost determinat în serul de șoarece folosind haptoglobina de șoarece ELISA Duoset (Bio-Techne, Minneapolis, MN, SUA; Cat # DY4409).

Macrofage Epuizare in vivo

Cu două zile înainte de tratamentul DSS, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 200 μl de lipozomi goi sau lipozomi încărcați cu clodronat (Liposoma BV, Amsterdam, Țările de Jos; Cat # CP-010-010) pentru a epuiza monocitele de sânge și, probabil, unele macrofage tisulare din splină și colon (38). Pentru a menține și a promova epuizarea pe parcursul întregii perioade de tratament DSS, am injectat șoarecii la fiecare 3 zile începând cu 2 zile înainte de introducerea DSS (ziua -2, ziua 1 și ziua 4).

Măsurarea culturilor de celule tisulare și citokinelor

Țesutul de colon a fost cultivat ex vivo așa cum s-a descris anterior (37). Pe scurt, au fost colectate, cântărite și cultivate în 500 μl de mediu RPMI complet (Merck; Cat # R0883), conținând 10% ser fetal bovin fetal inactivat termic (Biochrom GmbH, Germania; Cat # S 0115) Soluție 1% Antibiotic-Antimicotic (Merck) într-un incubator umidificat (37 ° C, 5% CO2) timp de 48 de ore. Supernatanții au fost colectați și depozitați la -20 ° C până la analiză. Citokinele au fost măsurate în supernatante de cultură tisulară folosind seturi ELISA adecvate (Bio-Techne; Cat # DY410, DY406, DY401 și DY3626) conform instrucțiunilor producătorului.

Pregătirea celulelor și analiza citometriei în flux

Suspensiile cu o singură celulă de la ganglionii limfatici mezenterici (mLN) și spline au fost preparate prin întrerupere mecanică și trecute printr-un filtru de celule de 70 μm (Becton Dickinson; Cat # 352350). După spălare (300 × g, 5 min, 4 ° C), globulele roșii din sange au fost lizate prin incubare de 5 min în tampon de lizare RBC (1 mM EDTA, 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3). Supernatantul cu globule roșii lizate a fost îndepărtat și celulele au fost utilizate pentru analize ulterioare. Suspensiile cu celule unice de la colon au fost preparate folosind protocolul publicat (39). Apoi, celulele au fost blocate de ser normal de șoarece și incubate cu anticorpi conjugați cu fluorocrom care recunosc epitopii extracelulari (Tabelul suplimentar 1). Apoi, celulele au fost tratate cu eBioscience ™ Foxp3/Set de tampon de colorare a factorului de transcripție (Thermo Fisher Scientific; Cat # 00-5523-00) și colorate pentru antigeni intracelulari (Tabelul suplimentar 1). Pentru a distinge celulele viabile și cele moarte, Fixable Viability Dye - eFluor 780 (Thermo Fisher Scientific; Cat # 65-0865-18) a fost adăugat la amestecul de colorare înainte de fixare. Datele au fost obținute prin măsurarea probelor pe LSRII (BD Biosciences, CA) și software-ul FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR; RRID: SCR_008520) a fost utilizat pentru analiza datelor. Exemplul de strategie de gating folosit este prezentat în figura suplimentară 7.

PCR în timp real

Bună analiză a microbiotei

Bună metabolomică a microbiotei

În ziua 0, o peletă fecală de

25 mg de la fiecare șoarece au fost colectați și omogenizați prin agitare vigurosă în 500 μl de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS; pH = 7,4). Apoi, proba a fost centrifugată (13.000 × g timp de 10 min) pentru a îndepărta particulele și supernatantul a fost transferat într-un tub proaspăt de microfugă și centrifugat din nou. Supernatantul rezultat a fost liofilizat la -58 ° C peste noapte, resuspendat în D2O (500 pl) conținând 0,01% acid trimetilsilil propionic ca standard intern și transferat într-un tub de 5 mm RMN. Spectrele RMN au fost înregistrate pe un spectrometru Bruker Avance III de 600 MHz (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Germania) echipat cu un cap de sondă criogenică TCI de 5 mm. O descriere mai detaliată a condițiilor experimentale ale analizei RMN și a etapelor de procesare corespunzătoare este prezentată în Informații suplimentare. Conținutul total de proteine ​​din filtratele de pelete fecale a fost măsurat prin testul acidului bicinchoninic (BCA) (Kit Pierce ™ BCA Protein Assay Kit; ThermoFisher Scientific; Cat # 23227) conform recomandărilor producătorului.

Analize statistice

Analiza unică a varianței (ANOVA) cu testul de comparație multiplă al lui Tukey a fost utilizată pentru a compara mai multe grupuri experimentale. ANOVA bidirecțional cu Bonferoni post-test a fost utilizat pentru determinarea greutății semnificative și a modificărilor DAI. Diferențele dintre două grupuri au fost evaluate utilizând testul t al Studentului cu două cozi nepereche. Datele sunt prezentate ca medie ± abaterea standard și diferențele au fost considerate semnificative statistic la P ≤ 0,05. Software-ul statistic GraphPad Prism (versiunea 5.0, GraphPad Software, RRID: SCR_002798) a fost utilizat pentru analize.

Rezultate

Dieta bogată în proteine ​​de origine animală agravează colita acută, în timp ce dieta bogată în proteine ​​de origine vegetală nu