Katrin S. Blum

1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,

Sinem Karaman

1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,

Steven T. Proulx

1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,

Alexandra M. Ochsenbein

1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,

Paola Luciani

1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,

Jean-Christophe Leroux

1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,

Christian Wolfrum

2 Institutul de Alimentație, Nutriție și Sănătate, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Schwerzenbach, Elveția,

Michael Detmar

1 Institutul de Științe Farmaceutice, Institutul Federal Elvețian de Tehnologie, ETH Zurich, Zurich, Elveția,

Conceput și proiectat experimentele: KSB SK STP CW MD. A efectuat experimentele: KSB SK STP. Analiza datelor: KSB SK STP MD. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: AMO PL JCL. Am scris lucrarea: KSB SK STP MD.

Date asociate

Abstract

Introducere

Am urmărit să investigăm dacă și cum obezitatea indusă de dietă afectează morfologia și funcția vasculaturii limfatice. În acest scop, șoarecii au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) și apoi am efectuat evaluări morfometrice ale vaselor limfatice și am utilizat imagini de înaltă rezoluție cu infraroșu apropiat (NIR) pentru a investiga cantitativ funcția de colectare a vaselor limfatice în piciorul posterior al șoareci in vivo. În trei tulpini de șoareci diferite, am constatat că HFD a fost asociat cu o afectare a funcției de colectare a vasului limfatic. Aceste descoperiri implică faptul că disfuncția limfatică poate fi indusă de expansiunea țesutului adipos.

Materiale și metode

3.1 Modele animale - Declarație de etică

C57BL/6J masculin: Șoareci ICR (n = 20), șoareci FVB (n = 16) și șoareci K14-VEGF-C [13] (n = 8) au fost păstrați în condiții SPF convenționale. Pentru fiecare tulpină, începând cu vârsta de 4 săptămâni, jumătate din șoareci au primit acces ad libitum la chow standard (chow; 11% kcal din grăsimi, 31% kcal din proteine ​​și 58% kcal din carbohidrați; Provimi-Kliba, Kaiseraugst, Elveția) și cealaltă jumătate până la dieta bogată în grăsimi (HFD; 60% kcal din grăsimi, 20% kcal din proteine ​​și 20% kcal din carbohidrați; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, SUA) timp de 17 săptămâni sau 31 de săptămâni. Șoarecii au fost anesteziați prin i.p. injectarea a 0,2 mg/kg medetomidină și 80 mg/kg ketamină pentru imagistică. Șoarecii au fost sacrificați cu o supradoză de anestezie (1000 mg/kg ketamină/3,5 mg/kg medetomidină) urmată de luxație cervicală. Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu protocoalele animale aprobate de Kantonales Veterinäramt Zürich.

3.2 Analiza conținutului de apă

Conținutul de apă a fost analizat așa cum s-a descris anterior [9]. Pe scurt, probele de piele din spate au fost colectate cu pumni de biopsie de 6 mm (Acuderm, Fort Lauderdale, FL, SUA). Probele au fost cântărite după colectare și liofilizate timp de 24 de ore. Ulterior, probele au fost cântărite din nou și s-a calculat pierderea în greutate. Deoarece această procedură a eliminat apa din țesuturi, pierderea în greutate a reprezentat conținutul de apă al țesutului.

3.3 Analize de histologie și imunofluorescență

Criosecțiile cozilor (7 μm) au fost fixate timp de 2 minute în acetonă (–20 ° C) și timp de 5 minute în metanol 80% (4 ° C), spălate în PBS și incubate peste noapte (4 ° C) cu un anti hamster -corp anticodoplanină (clona 8.1.1, Developmental Studies Hybridoma Bank, Universitatea din Iowa) și anticorp anti-Meca32 de șobolan (1 200, BD Pharmingen, Allschwil), sau anti-iepure anti-LYVE-1 (1 600, AngioBio) și șobolan anti-CD31 (1∶200, BD Pharmingen). Probele au fost apoi incubate timp de 30 de minute cu anticorpi secundari conjugați Alexa488 și Alexa594 (1 200) și Hoechst 33342 (1 1000 000; toți din Invitrogen, Basel, Elveția). Colorarea regulată a hematoxilinei a fost utilizată pentru a colora secțiunile de parafină (8 μm) ale cozii.

3.4 Analize morfometrice și morfologice

Petele de imunofluorescență ale secțiunilor pielii cozii pentru vasele limfatice pozoplanin-pozitive și pentru vasele de sânge Meca32-pozitive au fost examinate pe un microscop Axioskop 2 mot plus (Carl Zeiss, Feldbach, Elveția) și imaginile de la 3 la 5 câmpuri vizuale individuale pe secțiune au fost achiziționate cu o cameră AxioCam MRc cu un obiectiv Plan-APOCHROMAT 10 ×/0,45 NA și software-ul AxioVision 4.7.1 (Carl Zeiss, Feldbach, Elveția). Grosimea epidermei, a dermei și a țesutului adipos a fost determinată pe secțiuni de parafină colorate cu hematoxilină ale pielii cozii. Analizele morfometrice ale vaselor și ale grosimii țesuturilor au fost efectuate cu software-ul ImageJ [14].

3.5 Imunocolorarea întregii monturi

3.6 Imagistica in vivo a funcției vaselor limfatice

Pentru imagistica limfatică a fost utilizat un stereomicroscop Zeiss StereoLumar.V12 adaptat pentru vizualizarea NIR [15]. Videoclipurile au fost înregistrate în timpul injectării intradermice a trasoarelor limfatice specifice P20D680 sau P40D680 în picior [15]. Videoclipuri suplimentare pentru a vizualiza contractilitatea colectării vaselor limfatice care drenează membrul inferior au fost achiziționate înainte și după mecanostimularea locului de injectare. Mecanostimularea a fost efectuată folosind un tampon de bumbac presat ușor pe locul injectării o dată pe secundă timp de zece secunde pentru a stimula absorbția limfatică inițială a trasorului și a demonstra capacitatea sistemului limfatic de a reacționa la o încărcare bruscă de lichid [15]. O analiză a regiunii de interes (ROI) a intensității fluorescenței a fost efectuată pentru a evalua frecvența colectării contracțiilor vaselor limfatice. Răspunsul la mecanostimulare a fost evaluat prin determinarea modificării intensității fluorescenței medii în perioadele de 30 s imediat înainte de mecanostimulare și începând de la 30 s după mecanostimulare.

3.7 Analiza zonei pielii perfuzate

Două-trei imagini NIR ale membrului posterior au fost combinate împreună pentru a obține o imagine de ansamblu asupra întregului picior - inclusiv glezna și treimea distală a membrului superior - utilizând software-ul Photoshop v 5.0 (Adobe Systems). Un ROI dreptunghiular de 6 mm lățime și 15 mm înălțime a fost plasat pe imaginea NIR, luând punctul de mijloc al arcului vasului limfatic colector dorsal ca punct de referință, iar imaginea a fost decupată. Suprafața totală a pielii și zona perfuzată cu vopsea în cadrul imaginii decupate au fost apoi măsurate prin selecție manuală folosind instrumentul lasso poligonal al software-ului Photoshop. Suprafața perfuzată a fost apoi calculată ca procent din suprafața totală a pielii.

3.8 Analize statistice

Toate datele sunt prezentate ca medie ± SD. Mijloacele de grup au fost comparate folosind testul t Student; Corecția lui Welch a fost utilizată în cazul variațiilor inegale, iar testul U Mann-Whitney a fost utilizat pentru comparațiile datelor distribuite în mod normal. P Figura 1A). Conținutul de apă al pielii din spate a fost redus după 17 săptămâni pe HFD (FVB: HFD, 0,41 ± 0,11 mL/g vs. chow, 0,53 ± 0,10 mL/g; P = 0,0405; C57BL/6J: ICR: HFD, 0,34 ± 0,06 mL/g vs. chow, 0,53 ± 0,06 mL/g; P = 0,0013; Figura 1B). O creștere semnificativă a țesutului adipos cu adipocite hipertrofice (Figura 1C și D) a fost detectată în cozi (grosimea stratului subcutanat în HFD, 269,5 ± 18,4 μm față de chow, 150,8 ± 15,9 μm; P Figura 1E).

afectează

Creșterea semnificativă a greutății corporale (A) și reducerea conținutului de apă al pielii în pielea din spate (B) după 17 săptămâni de HFD. Colorările hematoxilinei (C, D) și analizele cantitative ale imaginii (E) au relevat o grosime semnificativ crescută a țesutului adipos, dar nu a epidermei sau a dermei, în pielea cozii șoarecilor C57BL/6J: ICR HFD. Petele de imunofluorescență pentru podoplanină (F, G; roșu; vasele limfatice) și Meca32 (H, I; verde; vasele de sânge) și analizele cantitative ale imaginii (J) au relevat o reducere a dimensiunii medii a vaselor limfatice dermice, dar nu și a dimensiunii vaselor de sânge, după HFD. Barele de scară = 100 μm. Datele reprezintă media ± SD. * P≤0,05, ** P≤0,01, *** P≤0,001.

4.2 Densitatea comparabilă a vaselor limfatice inițiale în piele

Petele de imunofluorescență pentru vasele de sânge și vasele limfatice au fost făcute folosind anticorpi împotriva podoplaninei și Meca32. Analizele morfometrice ale vaselor de sânge și ale vaselor limfatice din derma cozii au arătat că șoarecii hrăniți cu HFD au avut o tendință spre dimensiunea medie redusă a vasului limfatic dermic (151,0 ± 53,3 μm 2) comparativ cu șoarecii hrăniți cu chow (240,2 ± 140,4 μm 2; NS), întrucât vasele de sânge au rămas neafectate (HFD, 95,8 ± 8,8 μm 2 vs. chow, 99,9 ± 28,0; NS; Figura 1F-J). Această tendință a fost observată și atunci când cozile au fost colorate pentru LYVE-1 și CD31 (Figura 1K și L).

4.3 Funcția afectată a vasului limfatic de colectare la șoareci alimentați cu HFD

Apoi am evaluat funcția vasului de colectare în membrele șoarecilor folosind imagistica NIR (Figura 2A). Am vizualizat și cuantificat mai întâi frecvența de contracție a vaselor limfatice aferente de colectare lângă intrarea în LN popliteu. De asemenea, am determinat răspunsul la o sarcină acută de fluid - prin mecanostimulare - a colectoarelor aferente din membrul inferior în timpul mecanostimulării la locul injectării.

Imagistica NIR (A) a fost efectuată după injectarea intradermică de 5 μL de 25 μM P20D680, un trasor specific pentru absorbția în vasele limfatice. Analiza contractilității vaselor limfatice de colectare a fost efectuată pe vasele aferente din apropierea LN poplitee, în timp ce răspunsul la mecanostimularea locului de injectare printr-un tampon de bumbac a fost evaluat pe vasele limfatice de colectare ale membrului inferior. Modele de contracție normale (B) și neregulate (C) la șoareci Chow și, respectiv, HFD. Analiza de regresie liniară (D) arată o corelație negativă semnificativă între greutatea și frecvențele de contracție. Răspuns normal (E) și afectat (F) la mecanostimulare. Șoarecii cu HFD au prezentat un răspuns redus la mecanostimulare (G) în comparație cu șoarecii din dieta chow. ** P≤0,01.

Am constatat că contractilitatea colectării vaselor limfatice în picioarele posterioare ale șoarecilor hrăniți cu chow părea normală, cu frecvențe de contracție de aproximativ 9 pe minut (Figura 2B, Figura S1A și Video S1). În contrast, contracțiile vaselor limfatice de colectare la șoareci HFD au fost fără un model definit (Figura 2C, Figura S1A și Video S2), iar frecvențele de contracție au fost semnificativ reduse (chow: 9,0 ± 1,7 contracții/min vs. HFD: 4,2 ± 1,1 contracții/min, P = 0,0002). A existat o corelație inversă semnificativă între greutatea șoarecilor și frecvențele de contracție atât în ​​FVB (r 2 = 0,68, P = 0,001; Figura 2D), cât și în C57BL/6J: ICR (r 2 = 0,52, P = 0,028; Figura S1A ) tulpini.

De asemenea, am găsit un răspuns redus la mecanostimulare la șoareci pe HFD. Șoarecii normali au prezentat un model tipic de creștere imediată a semnalului în vasele limfatice de colectare din aval în timpul mecanostimulării locului de injectare, urmată de o scădere lentă a semnalului în timp (Figura 2E). În schimb, majoritatea șoarecilor de pe HFD au avut o creștere redusă a semnalului în timpul mecanostimulării și nicio scădere aparentă a semnalului în timp (Figura 2F). Am cuantificat acest răspuns utilizând modificarea intensității fluorescenței medii a vaselor limfatice colectoare, înainte și după mecanostimulare. Folosind această evaluare, am constatat o reducere semnificativă a creșterii semnalului după mecanostimulare în colectarea vaselor limfatice sub HFD în ambele FVB (chow: 2,4 ± 1,3 ori față de HFD: 1,5 ± 0,5 ori, P = 0,0079; Figura 2G) și C57BL/6J: șoareci ICR (chow: 2,9 ± 0,1 ori vs. HFD: 1,2 ± 0,2 ori, P = 0,0159; Figura S1B).

4.4 Mărirea vaselor limfatice colectoare la nivelul membrului inferior

Colorările CD31 (A, verzi) și αSMA (B, roșii) ale vaselor limfatice colectoare de la șoareci hrăniți cu diete au fost comparate cu colorările CD31 (D) și αSMA (E) ale vaselor limfatice colectoare de la șoareci alimentați cu HFD. S-a observat că vasele limfatice colectoare au fost mărite la șoarecii hrăniți cu HFD. Colorările CD31 (G, verde) și αSMA (H, roșu) ale vaselor limfatice care colectează urechea necontractilă de la șoareci hrăniți cu dietă chow au fost comparate cu colorările CD31 (J, verzi) și αSMA (K, roșu) de la șoareci alimentați cu HFD. Nu s-au observat diferențe majore. Canalele combinate sunt afișate în (C, F, I și L). Barele de scară = 50 μm.

4.5 Scăderea răspândirii trasorului în vasele limfatice dermice la șoarecii K14-VEGF-C după HFD

Șoarecii K14-VEGF-C au o rețea de vase limfatice dermice extinse și prezintă o răspândire crescută a trasorilor prin aceste vase dintr-un loc de injectare intradermică (Figura S2) [13], [17], [18]. Acești șoareci au, de asemenea, vase limfatice de colectare mărită în piele, comparativ cu șoarecii de tip sălbatic (datele nu sunt prezentate). Am emis ipoteza că expansiunea indusă de HFD a țesutului adipos subcutanat poate modifica răspândirea trasorului limfatic în vasele limfatice dermice inițiale ale șoarecilor K14-VEGF-C. Similar cu rezultatele la șoareci de tip sălbatic, am găsit frecvențe de contracție a vaselor limfatice colectoare neregulate la șoareci K14-VEGF-C pe HFD (Figura 4A-C), cu o corelație inversă semnificativă între frecvența contracțiilor limfatice și greutatea corporală (r 2 = 0,75, P = 0,0053). Șoarecii K14-VEGF-C sub dieta chow au prezentat o răspândire pronunțată a trasorului limfatic în vasele limfatice dermice expandate (Figura 4D și Video S3). În schimb, răspândirea trasorului a fost redusă în condiții de HFD (Figura 4E și Video S4), rezultând o diferență semnificativă în zona pielii care este perfuzată cu trasor în vasele limfatice dermice între șoareci chow și HFD (chow: 62,1 ± 25,7% față de HFD: 8,5 ± 8,0%, P = 0,0286; Figura 4F).

Imagistica NIR a fost efectuată după injectarea intradermică de 5 μL de 25 μM P20D680. Modele de contracție normale (A) și neregulate (B) la șoareci Chow și, respectiv, HFD. Analiza de regresie liniară (C) arată o corelație negativă semnificativă între greutatea și frecvențele de contracție. Răspândirea ridicată (D) și scăzută (E) a trasorului în vasele limfatice dermice la șoareci hrăniți, respectiv HFD, după 15 minute de imagistică. Barele de scară = 2 mm. Cuantificarea (F) arată un procent mai mic de vase limfatice perfuzate cu trasor ale pielii la nivelul membrului inferior al șoarecilor pe HFD în comparație cu dieta chow. * P≤0,05.

Discuţie

Prezentul studiu relevă modificări morfologice și funcționale ale colectării vaselor limfatice la extremitățile șoarecilor obezi. Cu imagistica limfatică NIR a colectării vaselor limfatice, am constatat o frecvență scăzută a contracțiilor și un răspuns redus la mecanostimulare în trei tulpini de șoareci diferite hrănite cu HFD. Din punct de vedere morfologic, vasele limfatice de colectare contractile ale membrului posterior au apărut mai mari la șoarecii hrăniți cu HFD comparativ cu șoarecii hrăniți cu chow. Împreună cu constatările noastre de răspândire redusă a trasoarelor în vasele limfatice dermice la șoarecii K14-VEGF-C alimentați cu HFD, aceste descoperiri sugerează că o expansiune crescută a țesutului adipos subcutanat ca răspuns la HFD poate fi în detrimentul transportului limfatic. Aceste descoperiri sunt în acord cu raportul recent privind transportul limfatic redus la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi utilizând tehnici de imagistică PET-CT [10]. Rezultatele noastre indică faptul că această capacitate de transport redusă poate fi parțial cauzată de efectele asupra vaselor limfatice colectoare, pe lângă modificările structurale din ganglionii limfatici de drenaj, sugerate într-un studiu anterior [10].

informatii justificative

Figura S1

Vase limfatice colectoare afectate funcționează după 17 săptămâni de HFD la șoareci C57BL/6J: ICR. Imagistica NIR a fost efectuată după injectarea intradermică a 5 μL de 25 μM P40D680, un trasor specific pentru absorbția în vasele limfatice. (A) Modele de contracție normale și neregulate la șoareci Chow (n = 5) și, respectiv, HFD (n = 5). Analiza de regresie liniară arată o corelație negativă semnificativă între greutatea și frecvențele de contracție. (B) Răspuns normal și afectat la mecanostimulare. Videoclipurile au fost inițiate la 15 s după mecanostimulare. Șoarecii cu HFD au prezentat un răspuns redus la mecanostimulare în comparație cu șoarecii din dieta chow. ** P≤0,01

Figura S2

Răspândirea trasorilor în vasele limfatice dermice la șoarecii K14-VEGF-C. Imagistica NIR a fost efectuată după injectarea intradermică a 5 μL de 25 μM P20D680 la șoareci K14-VEGF-C. Datorită hiperplaziei vaselor limfatice dermice din această tulpină de șoarece, trasorul se răspândește în această rețea superficială de vase, mai degrabă decât să se scurgă predominant în vasele limfatice colectoare mai profunde. Șoarece reprezentativ la 5 minute după injecție (A) și la 10 minute după injecție (B). Mărirea mai mare (C) demonstrează că trasorul este conținut în vasele limfatice dermice.

Video S1

Imagistica limfatică NIR a vaselor limfatice colectoare aferente care se scurg în LN popliteu la un șoarece FVB după 17 săptămâni de dietă chow. Imagistica a fost efectuată după injectarea P20D680 (5 μL de 25 μM) în pielea dorsală a piciorului și a fost observată absorbția în vasele limfatice colectoare. Videoclipul are o viteză normală de 10 ori și a fost achiziționat cu filtrul Cy5 setat la 1 cadru/s.

Video S2

Imagistica limfatică NIR a vaselor limfatice colectoare aferente care se scurg în LN popliteu la un șoarece FVB după 17 săptămâni de HFD. Imagistica a fost efectuată după injectarea P20D680 (5 μL de 25 μM) în pielea dorsală a piciorului și a fost observată absorbția în vasele limfatice colectoare. Videoclipul are o viteză normală de 10 ori și a fost achiziționat cu filtrul Cy5 setat la 1 cadru/s.

Video S3

Imagistica NIR a vaselor limfatice la nivelul membrului inferior la un șoarece K14-VEGF-C după 17 săptămâni de dietă chow. Imagistica a fost inițiată la 30 s după injectarea P20D680 (5 μL de 25 μM) în pielea dorsală a piciorului. S-a observat răspândirea trasorului limfatic în vasele limfatice dermice. Videoclipul are o viteză normală de 10 ori și a fost achiziționat cu filtrul Cy5 setat la 1 cadru/s.

Video S4

Imagistica NIR a vaselor limfatice care se scurg la nivelul membrului inferior la un șoarece K14-VEGF-C după 17 săptămâni de HFD. Imagistica a fost inițiată la 30 de ani după injectarea P20D680 (5 μL de 25 μM) în pielea dorsală a piciorului. Nu s-a observat nicio răspândire a trasorului limfatic în vasele limfatice dermice. Videoclipul are o viteză normală de 10 ori și a fost achiziționat cu filtrul Cy5 setat la 1 cadru/s.

Mulțumiri

Mulțumim lui Jeannette Scholl pentru asistență tehnică excelentă și lui Carlos Ochoa pentru ajutor la experimentele pe animale.

Declarație de finanțare

Această lucrare a fost susținută de subvențiile Fundației Naționale Elvețiene pentru Științe 31003A_130627 și 310030B_137087, Grantul European de Cercetare Avansată LYVICAM și Fundația Rețelelor Transatlantice Leducq de Excelență în Cercetarea Cardiovasculară (către MD). KSB a primit o bursă de cercetare de la Fundația Germană pentru Cercetare (DFG: BL 1136/1-1). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.