Jiří Danihlík

1 Departamentul de Biochimie și Proteomică a Proteinelor, Centrul Regiunii Haná pentru Cercetări Biotehnologice și Agricole, Facultatea de Științe, Universitatea Palacký din Olomouc, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Republica Cehă; [email protected] (J.D.); [email protected] (R.L.); [email protected] (M.Š.)

2 Departamentul de Biochimie, Facultatea de Științe, Universitatea Palacký din Olomouc, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Republica Cehă; [email protected]

Mária Škrabišová

3 Departamentul de Biologie Moleculară, Centrul Regiunii Haná pentru Cercetări Biotehnologice și Agricole, Facultatea de Științe, Universitatea Palacký din Olomouc, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Republica Cehă; [email protected]

René Lenobel

1 Departamentul de Biochimie și Proteomică a Proteinelor, Centrul Regiunii Haná pentru Cercetări Biotehnologice și Agricole, Facultatea de Științe, Universitatea Palacký din Olomouc, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Republica Cehă; [email protected] (J.D.); [email protected] (R.L.); [email protected] (M.Š.)

Marek Šebela

1 Departamentul de Biochimie și Proteomică a Proteinelor, Centrul Regiunii Haná pentru Cercetări Biotehnologice și Agricole, Facultatea de Științe, Universitatea Palacký din Olomouc, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Republica Cehă; [email protected] (J.D.); [email protected] (R.L.); [email protected] (M.Š.)

Eslam Omar

4 Institutul de Biologie, Universitatea din Graz, Universitätsplatz 2, 8010 Graz, Austria; ge.ude.nua@ramomalse (E.O.); [email protected] (K.C.)

Marek Petřivalský

2 Departamentul de Biochimie, Facultatea de Științe, Universitatea Palacký din Olomouc, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Republica Cehă; [email protected]

Karl Crailsheim

4 Institutul de Biologie, Universitatea din Graz, Universitätsplatz 2, 8010 Graz, Austria; ge.ude.nua@ramomalse (E.O.); [email protected] (K.C.)

Robert Brodschneider

4 Institutul de Biologie, Universitatea din Graz, Universitätsplatz 2, 8010 Graz, Austria; ge.ude.nua@ramomalse (E.O.); [email protected] (K.C.)

Date asociate

Abstract

1. Introducere

Lipsa nutrienților importanți în dieta albinelor poate duce la o reducere a numărului de larve sau la o vitalitate slăbită a adulților din coloniile de albine de miere [1]. Cei mai necesari nutrienți sunt zaharurile, proteinele și lipidele conținute în nectar și polen. Albinele adulte necesită o dietă adecvată și echilibrată pe parcursul vieții lor, deoarece se confruntă cu sarcini și provocări variabile. Calitatea nutrițională a polenului diferă între speciile de plante, cu o variabilitate semnificativă a conținutului total de proteine, lipide, zaharuri și aminoacizi, precum și a capacității antioxidante [2]. Aportul mediu de polen pe albină este de 3,4–4,3 mg/zi, cea mai mare cantitate de polen fiind consumată de albinele alăptătoare [3]. Pe lângă sursele de dietă naturală colectate de albine în timpul sezonului (nectar, mierat, polen), se știe că diferite diete cu carbohidrați care sunt hrănite coloniilor ca hrană de iarnă provoacă expresii diferențiale ale diferitelor gene din corpurile de grăsime ale albinelor [4].

Insectele sociale, în general, posedă un număr mai mic de gene legate de imunitate în comparație cu insectele solitare [5,6]. Există trei niveluri de imunitate a albinelor care se reflectă în interacțiunile lor cu agenții patogeni - bariere fizice, imunitate celulară și imunitate umorală și, în plus, albinele ca insecte sociale au dezvoltat un tip special de imunitate - imunitatea socială [7,8]. Aportul nutrițional al albinelor de miere și eficacitatea răspunsurilor imune individuale apar într-o posibilă relație reciprocă [9]. Partea umorală a imunității albinelor lucrătoare constă din enzime, lectine și peptide antimicrobiene (AMP). Gätschenberger și colab. [10] a arătat că puterea imunitară generală a albinelor de vară și de iarnă a rămas la același nivel. Cu toate acestea, atunci când albinele sunt extrem de infectate cu virusul aripii deformat, genele imunității celulare sunt reglate în jos, în timp ce expresia genelor imune umorale crește [11]. Condițiile de stres, induse de expunerea la doze subletale de neonicotinoizi, compromit și imunocompetența individuală a albinelor [12].

Lucrarea de cercetare publicată care se ocupă de schimbările în expresia genelor pentru AMP-urile de albine de miere ca răspuns la stimuli specifici s-a bazat în principal pe analize PCR cantitative ale țesuturilor albinelor sau ale corpurilor întregi [21,22,23]. În plus, alte câteva metode, cum ar fi electroforeza pe gel de poliacrilamidă, cromatografia lichidă de înaltă performanță și spectrometria de masă au fost utilizate pentru detectarea și cuantificarea peptidelor antimicrobiene în probe combinate de un număr mare de albine [14,24,25]. Studiile asupra AMP-urilor pentru albine se referă în principal la modificări în expresia genelor corespunzătoare, deoarece până acum au fost publicate doar câteva rapoarte privind cuantificarea nivelurilor de peptide AMP. O metodă analitică nouă și extrem de sensibilă a fost recent dezvoltată pentru cuantificarea izoformelor apidaecinei 1 în hemolimfa sau părțile corpului fiecărei albine individuale, care este considerată a fi un instrument promițător pentru cuantificarea exactă a AMP-urilor pentru albine [26].

Aici, am investigat modificările parametrilor selectați ai sistemului imunitar umoral la albinele individuale cărora li s-au administrat diferite diete de polen. Am analizat expresia relativă a genelor care codifică apidaecinele și abaecina în abdomenele albinelor, unde sunt sintetizate în corpurile grase. De asemenea, raportăm prima măsurare cantitativă a nivelurilor izoformelor active ale apidaecinei 1 în toracele albinelor, unde sunt prezente în hemolimfa circulantă, la nivelul individual al albinelor menținute in vitro.

2. Materiale și metode

2.1. Produse chimice

Standardele sintetice ale apidaecinei 1A și izotopic [13 C6 15 N4] marcate cu apidaecina 1A (la capătul C-terminal) au fost sintetizate de Clonestar (Brno, Republica Cehă). Ambele standarde peptidice sintetice în soluții au fost cuantificate prin analiza aminoacizilor de către Protein Analysis Group, Functional Genomics Center, Swiss Federal Institute of Technology, Zurich, Elveția. Acetonitril, metanol, apă (toate de calitate LC/MS), 98% (v/v) acid formic și acid trifluoroacetic p.a. au fost de la Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania). 2-propanolul pentru spectroscopie a fost de la Merck (Darmstadt, Germania). Toate substanțele chimice utilizate în cuantificarea expresiei genelor au fost achiziționate în calitate de biologie moleculară.

2.2. Creșterea și hrănirea albinelor

Am incubat faguri de puiet sigilați din mai multe colonii de Apis mellifera carnica de la Institutul de Zoologie, Graz, la 34,5 ° C în condiții standard pentru a obține lucrători de albine nou-născuți, cu vârsta mai mică de 24 de ore [27]. Albinele au fost alese la întâmplare și amestecate înainte de a fi introduse în cuști experimentale formate din cupe din plastic transparent. Cuștile au fost, de asemenea, furnizate cu o bară de ceară și experimentele au fost menținute timp de 18 zile. Fiecare cușcă conținea 100 de albine și experimentul a fost realizat în cuști duplicate pentru fiecare tip de dietă.

2.3. Pregătirea dietelor de polen și a factorilor nutriționali

Toate albinele au primit o soluție de zaharoză 50% (g/v) ad libitum. Toate cuștile, cu excepția uneia, au fost hrănite suplimentar cu una dintre următoarele diete proteice: Feedbee TM, o dietă suplimentară proteică disponibilă pe piață, care nu conține niciun produs de stup [28], sau polen corbicular conținând 94,8% din floarea-soarelui (Helianthus spp.), 91,2% mustar (Sinapis spp.), 70,6% sparanghel (Asparagus spp.) sau 87,6% castan (Castanea sativa). Vezi Omar și colab. [29] pentru mai multe detalii despre diete. Polenul monofloral a fost colectat de albine în Austria și ținut congelat până la utilizare. Grupul mixt de polen a primit un amestec de 25% (greutate/greutate) din fiecare dintre cele patru tipuri diferite de polen. Fiecare încărcare de polen a fost analizată palinologic la AGES - SPB, Abteilung, Bienenkunde und Bienenschutz, Lunz am See, Austria și frământată într-un aluat care a fost furnizat albinelor în cuști într-o jumătate de tuburi cilindrice de plastic de 10 ml [27]. Toate dietele de albine au fost reînnoite și ponderate zilnic. Consumul mediu cumulativ de diete în timpul celor 18 zile de hrănire a variat de la 42,52 mg/albină pentru sparanghel până la 68,28 mg/albină pentru dieta mixtă cu polen (a se vedea Materialul suplimentar S1).

2.4. Prelucrare de probă

Albinele experimentale au fost colectate, înghețate imediat și depozitate la -80 ° C până la utilizare. Înainte de prelucrare, albinele individuale înghețate au fost disecate în torace întregi, utilizate pentru cuantificarea izoformelor apidaecinei 1 și a abdomenelor, utilizate pentru cuantificarea expresiei genice a apidaecinelor și abaecinei.

2.5. Cuantificarea izoformelor Apidaecin 1

2.6. Testul proteinelor

Testul Bradford a fost aplicat într-un aspect microarray pentru cuantificarea proteinelor în probe. Albumina serică bovină a servit ca standard proteic [30].

2.7. Izolarea ARN și pregătirea ADNc

Abdominii individuali ai albinelor au fost omogenizați în tamponul GITC (300 µL per abdomen) [31]. Mini-kitul RNeasy Plant (Qiagen, Hilden, Germania) a fost utilizat pentru izolarea ARN-ului. Omogenatele (100 pl) au fost amestecate cu 350 (L de tampon RTL din kit și procesate, urmând instrucțiunile producătorului. În cele din urmă, concentrația de ARN a fost cuantificată prin absorbanță la 260 nm folosind un spectrofotometru de micro-volum BioSpec-nano (Shimadzu, Tokyo, Japonia). ADN-ul contaminant a fost digerat cu Turbo DNAse (Ambion by Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA) (Material suplimentar S3). Integritatea ARN a fost verificată prin electroforeză pe gel pe 1,1% (greutate/volum) gel de agaroză conținând bromură de etidiu. Kitul Transcriptor High Fidelity (Roche, Basel, Elveția) a fost utilizat pentru sinteza ADNc din ARN purificat, urmând instrucțiunile producătorului. Calitatea ADNc și posibila prezență a unei contaminări genomice a ADN-ului au fost testate prin electroforeză pe gel PCR (Material suplimentar S3) în gel de agaroză 3% (greutate/volum) cu bromură de etidiu ca metodă de detectare și cu un marker PCR de 50-1000 bp ( Promega, Madison, WI, SUA) ca standard.

2.8. Analiza expresiei genice

Reacția PCR cantitativă (qPCR) a fost efectuată pe un sistem de detecție PCR în timp real CFX96 Touch ™ (Bio Rad, Hercules, CA, SUA) cu SyberSelect ® Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA). Perechea de primer, care a fost concepută pentru a amplifica gena Apid1 (sinonim Apid14-pentru secvențe de primer vezi Material suplimentar S3), este universală pentru toate cele trei gene existente ale apidaecinei: Apid14 (Gene ID 406140), Apid22 (Gene ID 494510) și Apid73 (Gene ID 406115). Expresia genică a fost cuantificată în abdomen. Eficiența de amplificare a fost determinată pentru toți grundii (Material suplimentar S4). Specificitatea fiecărui test de expresie a genei qPCR a fost evaluată prin curba de topire de disociere corespunzătoare.

2.9. Cuantificarea nivelului relativ de expresie genică

Ambele HKG selectate, Arp1 și EF1a-F2, au fost utilizate pentru normalizarea genelor care codifică peptidele apidaecine și abaecin. Datele qPCR respectă instrucțiunile MIQE [34] (Material suplimentar S6).

2.10. Analize statistice

Graficele graficului de casetă au fost construite în OriginPro 9.0.0. Graficul graficului de casetă arată primul - al treilea quartile, în timp ce pătratele reprezintă medii și liniile arată mediane. Statistici de bază și ANOVA parametrice sau Kruskal-Wallis non-parametrice și teste statistice de comparație multiplă medie sau mediană post hoc au fost efectuate în Statistica 13 (64 de biți).

Stabilitățile de expresie ale genelor de menaj (HKG) care codifică Arp1 (HKG1) și EF1a-F2 (HKG2) au fost evaluate în BestKeeper [33] și expresiile relative ale genelor de interes (GOI) pentru apidaecine (GOI1) și abaecin ( GOI2) au fost calculate comparând raportul dintre expresia genelor menajere și a genelor de interes corectate în funcție de eficiența lor [35,36].

3. Rezultate

3.1. Efectul dietei polenice asupra nivelurilor izoformelor apidaecinei 1 în toracele albinelor

producția

Concentrația izoformelor apidaecinei 1 în toracele albinelor în cuști hrănite cu diete diferite. Grupurile sunt etichetate cu litere mici și mici; diferite litere denotă diferențe semnificative între grupuri (probe independente test Kruskal-Wallis, p 0,05; ANOVA unidirecțional, p> 0,05). Prin urmare, nu au fost efectuate comparații perechi. Media mare a concentrației de proteine ​​a fost de 65 proteine ​​protejante per mg de torace omogenizat (IC 95%: 60-70 µg/mg) (datele nu sunt prezentate).

3.2. Efectul dietei polenice asupra expresiei genelor apidaecinei și abaecinei

Au fost observate diferite tendințe în expresia genei apidaecinei și abaecinei. Deoarece normalitatea distribuției datelor în cadrul grupurilor experimentale a fost respinsă prin testul Shapiro-Wilk (p> 0,05), testul non parametric Kruskal-Wallis și comparația mediană post-hoc au fost utilizate pentru a evalua diferențele dintre grupurile experimentale. Albinele hrănite cu polen mixt și niciun polen nu au prezentat o expresie a genei apidaecinei semnificativ mai mică în comparație cu albinele hrănite cu polen de sparanghel, Sinapis sau Castanea (Figura 2 A). Nu s-au observat diferențe semnificative între albinele care au fost hrănite cu polen Helianthus sau FeedBee TM în comparație cu un polen mixt sau fără dietă de polen.

Expresia relativă a (A) apidaecină și (B) genele abaecinei au hrănit diferite diete. Grupurile sunt etichetate cu litere mici și mici; diferite litere denotă diferențe semnificative între grupuri (probe independente test Kruskal-Wallis, p TM, dar diferența nu a fost semnificativă pentru alte grupuri.

3.3. Corelarea concentrației de izoforme Apidaecin 1 în torace și expresia genelor în abdomen

Medianele concentrațiilor de apidaecină în torace au fost reprezentate grafic față de medianele de expresie genică în abdomenele tuturor grupurilor experimentale (Figura 3) și s-a stabilit un model de regresie liniar simplu: y = 0,782 (SE = 0,1484) x Pearson r = 0,95) . Un model liniar cu interceptare nu a fost acceptat deoarece interceptarea nu a fost semnificativ diferită de zero (95% CI = -0,76; 0,78).

Corelația expresiei relative a genelor apidaecinei și a nivelurilor izoformelor apidaecinei 1 în grupurile de albine care au fost hrănite cu diferite tipuri de dietă. Punctele individuale reprezintă valori mediane ale fiecărui grup.

4. Discutie

În general, proteina dietetică este o condiție prealabilă pentru sinteza proteinelor, inclusiv formarea izoformelor peptidei antimicrobiene apidaecina 1. Toate dietele proteice, cu excepția dietei mixte, au crescut concentrațiile izoformelor apidaecinei 1 în toracele albinelor de miere, în comparație cu dieta fara polen (Figura 1).

Se știe că nutriția optimă a proteinelor ar trebui să furnizeze un conținut echilibrat de aminoacizi esențiali, care este necesar albinelor [37,38]. Calitatea dietelor monoflorale depinde de modul în care îndeplinesc această cerință biochimică. Unora dintre polenele speciale, inclusiv cea a lui Helianthus, pot lipsi mai mulți aminoacizi, care sunt esențiali pentru nutriția albinelor [39]. Pe de altă parte, polenul de castan (Castanea spp.) Este considerat a avea o valoare nutritivă ridicată pentru albinele de miere [2]. Aici, arătăm că albinele care au fost hrănite cu polen Castanea au prezentat cea mai mare creștere a nivelurilor medii de izoforme ale apidaecinei 1 în torace în comparație cu albinele care nu au hrană cu polen. În general, amestecurile din diferite diete de polen sunt considerate a fi surse nutritive bune pentru albinele adulte [2,29].

Studii recente au confirmat schimbările în expresia genică a AMP-urilor în rețeaua de gene imune a albinelor ca răspuns la agenții patogeni și paraziți majori ai albinelor [21,23,43,44]. Cu toate acestea, se știe pe scară largă că nivelul de exprimare a genelor nu se corelează neapărat cu nivelurile de molecule active de peptide din țesutul albinelor. Acest lucru poate apărea, de exemplu, atunci când traducerea peptidei este reglată de microARN [45,46]. Aici, am găsit o corelație pozitivă între expresia genei apidaecinei în corpul adipos și nivelurile de apidaecină în toracele albinelor (Figura 3). Concentrate pe apidaecine, acestea sunt secretate ca preproteine: apidaecina tip 73, tip 22 și tip 14, aceste preproteine ​​sunt secretate de genele Apid73 (Gene ID 406115), Apid22 (Gene ID 494510) și Apid14 (Gene ID 406140). Preproteinele sunt în sfârșit îmbinate în trei izoforme active detectate la nivel peptidic: apidaecina 1 (izoformele 1A și 1B), apidaecina 2 și una apidaecină prezisă din biblioteca ADNc [13,15].

Proteinele alimentare sunt necesare pentru buna funcționare a mai multor căi imune ale albinelor [47]. Dieta cu polen, care este compusă din boabe de polen din mai multe specii botanice diferite, este adesea considerată a fi cea mai naturală și nutritivă dietă pentru albinele de miere [48,49,50]. Studiile anterioare privind adecvarea dietelor de proteine ​​artificiale pentru albinele de miere au adus rezultate controversate în funcție de trăsătura investigată a vitalității albinelor de miere [50,51]. În comparație cu diferitele diete de polen care au fost utilizate în experimentul nostru, nu au putut fi detectate avantaje sau dezavantaje izbitoare ale Feedbee ™ pe baza parametrilor evaluați ai imunității înnăscute, adică, concentrația izoformelor apidaecinei 1 și expresia genelor apidaecine și abaecine. În studiul nostru, nu am putut stabili fără echivoc dacă reglarea observată a genelor care codifică abaecina și apidaecinele la albinele hrănite cu diete suplimentate cu polen a fost atribuită doar valorii nutritive proteice a dietei sau evocată de antigeni sau alte componente chimice. Împreună cu alți factori de stres care reduc imunocompetența albinelor de miere (de exemplu, pesticide), malnutriția poate acționa sinergic influențând căile imune negative ale albinelor și capacitatea de apărare împotriva agenților patogeni [52,53,54].

5. Concluzii

Mulțumiri

Mulțumim lui Tomáš Fürst de la Universitatea Palacký din Olomouc pentru ajutor în analiza statistică.