Subiecte

Abstract

Adenovirusul uman 36 (Ad36) este asociat pozitiv cu obezitatea la oameni și animale. Infecția cu Ad36 se caracterizează prin creșterea adipozității și inflamației. Pentru a investiga posibilitatea ca un candidat profilactic de vaccin să protejeze împotriva obezității și inflamațiilor induse de Ad36, am purificat Ad36 și virusul iradiat cu ultraviolete pentru a obține un candidat vaccin. După imunizarea șoarecilor cu candidatul vaccin (grup vaccinat), Ad36 viu a fost injectat la șoareci ca test de provocare. Șoarecii nevaccinați (grupul martor) au fost imunizați cu soluție salină tamponată cu fosfat și apoi provocați cu Ad36 viu. La paisprezece săptămâni după provocare, am comparat adipozitatea și inflamația la șoarecii vaccinați și de control. Grupul de control a prezentat o greutate corporală cu 17% mai mare și cu 20% mai multe grăsimi epididimale comparativ cu grupul vaccinat. În plus, grupul vaccinat a scăzut nivelul seric al citokinelor pro-inflamatorii și a infiltrat celulele imune, în special macrofagele M1, în țesutul adipos. Prin urmare, candidatul la vaccin pentru Ad36 a reușit să protejeze împotriva greutății corporale și a grăsimilor crescute cu Ad36, precum și a stărilor inflamatorii după provocare. Aceste rezultate oferă dovezi de concept pentru vaccinarea profilactică împotriva adipozității induse de virus.

Introducere

Obezitatea este asociată cu un risc crescut de diabet de tip 2, boli cardiovasculare, tulburări gastrointestinale și mai multe tipuri de cancer. 1 Deoarece obezitatea a devenit una dintre principalele probleme de sănătate din societatea modernă, este necesar să se dezvolte strategii eficiente pentru gestionarea greutății. Medicamentele anti-obezitate aprobate în prezent au o eficacitate limitată, facilitând în general nu mai mult de 5-10% reducerea greutății corporale și sunt adesea asociate cu efecte secundare. 2 Astfel, există o nevoie medicală majoră pentru dezvoltarea de noi medicamente anti-obezitate.

Studii recente au arătat o asociere între infecția cu adenovirusul uman 36 (Ad36) și creșterea adipozității la oameni, șoareci, găini și maimuțe. Infecția cu 3, 4, 5 Ad36 la animale este asociată cu o greutate corporală crescută, grăsimi epididimale, grăsimi viscerale și grăsimi inghinale. 4.5 În plus, infecția cu Ad36 induce inflamația în țesuturile grase prin citokine inflamatorii și celule imune infiltrate. 6 Prin urmare, este necesar un vaccin anti-obezitate pentru a controla infecția cu Ad36.

În acest studiu, am inactivat Ad36 purificat prin iradiere ultravioletă (UV). Șoarecii injectați cu virusul inactivat au fost protejați de adipozitatea și inflamația indusă de Ad36. Astfel, rezultatele noastre oferă dovezi de concept pentru vaccinarea profilactică împotriva adipozității induse de virus.

Materiale și metode

Purificarea și inactivarea adenovirusului 36

Adenovirusul uman 36 (Ad36) a fost achiziționat din colecția American Type Culture Collection (Manassas, VA, SUA). Linia celulară A549 (celule epiteliale bazale alveolare umane adenocarcinomice), a fost utilizată pentru creșterea Ad36. Ad36 a fost recoltat din supernatantul celulelor A549 infectate, obținut prin înghețare-dezghețare de trei ori. Virusul a fost apoi purificat prin metoda CsCl. 7 Virusul purificat a fost inactivat prin iradiere utilizând reticulatorul UV 115 VAC (2500 mJ cm -2; GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, SUA). 8 Inactivarea virusului purificat iradiat cu UV a fost confirmată prin re-infecție la celulele A549 (datele nu sunt prezentate).

Îngrijire animale

Șoareci C57BL/6 de patru săptămâni au fost achiziționați de la Orient Bio Inc. (Seongnam, Coreea). Șoarecii au fost adaptați la condițiile de laborator (18-23 ° C, 55-60% umiditate, 12 h ciclu lumină/întuneric cu luminile aprinse la 0700 h). Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă normală și apă ad libitum. Aportul de alimente și apă, precum și greutatea corporală au fost monitorizate la șoareci în fiecare săptămână. Toți șoarecii au fost manipulați în conformitate cu liniile directoare și reglementările Asociației Coreene pentru Animale de Laborator. Protocolul a fost aprobat de Comitetul Internațional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor, Campusul Sungsim, Universitatea Catolică din Coreea (# 2012-017).

Vaccinarea și provocarea

Șoareci (COM)n= 10) au fost injectate intraperitoneal cu 5 μg de vaccin candidat și adjuvant complet (raport 1: 1, adjuvant complet Freund, # F5881; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA). La două săptămâni după prima imunizare, șoarecii au fost injectați din nou cu 5 μg de candidat vaccin și adjuvant incomplet (adjuvantul incomplet al lui Freund, # F5506; Sigma-Aldrich). La o săptămână după ultima imunizare, șoarecii au fost infectați intraperitoneal cu Ad36 viu (1 × 10 7 unități care formează placă per șoarece) pentru testul de provocare. Greutatea corporală a șoarecilor a fost monitorizată timp de 14 săptămâni după provocare. Grupul mouse-ului de control (n= 10) a fost injectat cu soluție salină tamponată cu fosfat amestecată cu același adjuvant, iar programele de injecție și provocare au fost exact aceleași cu grupul vaccinat. În acest sens, atât grupurile vaccinate, cât și grupurile de control au fost la fel de provocate cu Ad36 viu. Greutatea medie a șoarecilor în vârstă de 4 săptămâni atât în ​​grupurile de vaccinare, cât și în grupul martor a fost de 10-12 g, iar greutatea lor a fost de 14-15 g la începutul testului de provocare. Ambele grupuri au fost hrănite cu o dietă normală în timpul imunizării cu candidatul la vaccinare și provocate cu Ad36 viu.

analize statistice

Toate datele au fost analizate cu cele ale studentului t-testați utilizând programul SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, SUA). Datele sunt prezentate ca mijloace ± s.e. Comparații multiple au fost analizate prin analiza testului de varianță. Diferențele dintre medii au fost considerate semnificative statistic la P

Rezultate

Vaccinul candidat pentru Ad36 reduce creșterea în greutate și grăsimea

dovada

Vaccinul candidat pentru Ad36 reduce inflamația

Infecția cu Ad36 crește infiltrarea celulelor imune, cum ar fi macrofagele în țesuturile adipoase. 6 Celulele imune se infiltrează în țesutul adipos și secretă citokine ducând la o stare inflamatorie crescută și adipozitate. 6,9,10 În acest studiu, am observat că candidatul la vaccin a protejat șoarecii de infiltrarea celulelor imune în grăsimi epididimale. La paisprezece săptămâni după injectarea provocării, grăsimile epididimale au fost colectate de la șoareci și colorate cu hematoxilină și eozină. Celulele imune infiltrate au fost reduse în grupul vaccinat comparativ cu grupul martor (Figura 2a). Mai mult, grăsimile feliate au fost, de asemenea, colorate cu anticorp F4/80 pentru a confirma macrofagele infiltrate. Infiltrarea macrofagelor a fost, de asemenea, scăzută în grupul vaccinat comparativ cu grupul martor (Figura 2a).

Anterior, s-a raportat că obezitatea indusă de Ad36 crește inflamația prin citokine pro-inflamatorii, cum ar fi MCP 1 și TNF α. 6 Aici, nivelurile serice ale acestor două citokine au fost măsurate printr-o imunotestare la 14 săptămâni după provocare. Nivelurile serice ale MCP 1 au fost scăzute de patru ori în grupul vaccinat comparativ cu grupul martor (Figura 2b; P= 0,0002). Nivelurile de TNF α din grupul vaccinat au fost, de asemenea, reduse comparativ cu grupul martor (Figura 2b; P= 0,022). Mai mult, nivelurile de MCP 1 ARNm în grăsimile epididimale din grupul vaccinat au fost reduse comparativ cu grupul martor (Figura 2c; P= 0,0003). Cu toate acestea, expresia lui TNF a ARNm în grăsimile epididimale nu a fost semnificativ diferit între grupurile vaccinate și cele de control (Figura 2c; P= 0.446).

Macrofagele pot fi împărțite în două subtipuri pe baza răspunsului imun: macrofage M1 (macrofage pro-inflamatorii, CD64) și macrofage M2, CD206). 6 În prezentul studiu, grupul vaccinat a scăzut macrofagele M1 (P= 0,014) spre deosebire de macrofagele M2 (Figura 2d). Conform acestor rezultate, candidatul la vaccin a redus producția de citokine proinflamatorii serice, precum și infiltrarea celulelor imune după provocarea vie Ad36.

Discuţie

Ad36 este asociat cu obezitatea umană în SUA, Coreea și Italia. 3,11,12 În afară de oameni, infecția cu virusul induce adipozitatea la animale, inclusiv pui, șoareci, șobolani și maimuțe. 4.5 În plus, infecția cu Ad36 induce inflamația în țesutul adipos și menține o stare inflamatorie prin citokine pro-inflamatorii. 6 În cele din urmă, inflamația crescută este capabilă să susțină obezitatea. Prin urmare, este necesar să se dezvolte medicamente terapeutice sau vaccinuri profilactice care pot regla infecția virusului.

În prezentul studiu, am inactivat Ad36 prin iradiere UV pentru a crea un vaccin Ad36 candidat. Iradierea UV poate inactiva virușii fără efecte dăunătoare asupra structurii antigenice și funcției biologice a proteinelor. 13 Într-un studiu anterior, a fost de asemenea evaluat Ad36 iradiat cu UV. 8 Cu toate acestea, modificările greutății corporale și a grăsimii nu au fost observate la 4 zile după infecție. 8 De fapt, timp de 4 zile nu este suficient pentru a identifica modificările greutății corporale sau a grăsimilor după infecția cu Ad36. Prin urmare, am monitorizat greutatea corporală timp de 14 săptămâni după provocarea live-Ad36. Candidatul la vaccin a oferit protecție împotriva creșterii greutății corporale și a grăsimilor după provocarea Ad36 (Figura 1). Mai mult, candidatul la vaccin a diminuat inducerea citokinelor pro-inflamatorii, precum și a macrofagelor M1 în țesutul adipos prin infecția cu Ad36 (Figura 2); astfel, indicând faptul că vaccinul ameliorează inflamația indusă de Ad36.

Din câte știm, rezultatele acestui studiu sunt prima dovadă a conceptului pentru dezvoltarea unui vaccin împotriva Ad36.

Referințe

Reaven GM. Toți indivizii obezi nu sunt egali: rezistența la insulină este determinantul major al bolilor cardiovasculare la persoanele supraponderale/obeze. Diab Vasc Dis Res 2005; 2: 105-112.

Hainer V. Eficiență comparativă și siguranță a abordărilor farmacologice pentru gestionarea obezității. Îngrijirea diabetului 2011; 34: S349 - S354.

Atkinson RL, Dhurandhar NV, Allison DB, Bowen RL, Israel BA, Augustus AS și colab. Adenovirusul uman-36 este asociat cu creșterea greutății corporale și reducerea paradoxală a lipidelor serice. Int J Obes (Londra) 2005; 29: 281-286.

Dhurandhar NV, Israel BA, Kolesar JM, Mayhew GF, Cook ME, Atkinson RL. Creșterea adipozității la animale din cauza unui virus uman. Int J Obes Relat Metab Disord 2000; 24: 989–996.

Dhurandhar NV, Whigham LD, Abbott DH, Schultz-Darken NJ, Israel BA, Atkinson RL și colab. Adenovirusul uman Ad-36 promovează creșterea în greutate la maimuțele rhesus și marmoset. J Nutr 2002; 132: 3155–3160.

Pe HN, Nam JH. Adenovirusul 36 ca agent de obezitate menține starea de obezitate prin creșterea MCP-1 și inducerea inflamației. J Infect Dis 2012; 205: 914–922.

Tollefson AE, Kuppuswamy M, Shashkova EV, Doronin K, Wold WS. Pregătirea și titrarea stocurilor de adenovirus în bandă CsCl. Metode Mol Med 2007; 130: 223–235.

Pasarica M, Loiler S, Dhurandhar NV. Efectul acut al infecției cu adenovirus uman adipogen Ad36. Arch Virol 2008; 153: 2097-2102.

Lumeng CN, Saltiel AR. Legături inflamatorii între obezitate și boli metabolice. J Clin Invest 2011; 121: 2111–2117.

Sun S, Ji Y, Kersten S, Qi L. Mecanismele răspunsurilor inflamatorii în țesutul adipos obez. Annu Rev Nutr 2012; 32: 261-286.

Na HN, Kim J, Lee HS, Shim KW, Kimm H, Nam JH și colab. Asocierea adenovirusului uman-36 la adulții coreeni supraponderali. Int J Obes (Londra) 2012; 36: 281-285.

Trovato GM, Castro A, Tonzuso A, Garozzo A, Martines GF, Catalano D și colab. Relația obezității umane cu adenovirusul Ad36 și rezistența la insulină. Int J Obes (Londra) 2009; 33: 1402–1409.

Raviv Y, Viard M, Bess JW, Chertova E, Blumenthal R. Inactivarea retrovirusurilor cu păstrarea integrității structurale prin direcționarea domeniului hidrofob al învelișului viral. J Virol 2005; 79: 12394–12400.

Krishnapuram R, Dhurandhar EJ, Dubuisson O, Kirk-Ballard H, Bajpeyi S, Butte N și colab. Șablon pentru îmbunătățirea controlului glicemic fără a reduce adipozitatea sau grăsimile din dietă. Am J Physiol Endocrinol Metab 2011; 300: E779 - E789.

Trovato GM, Martines GF, Trovato FM, Pirri C, Pace P, Garozzo A și colab. Seropozitivitatea Adenovirus-36 îmbunătățește efectele intervenției nutriționale asupra obezității, a ficatului strălucitor și a rezistenței la insulină. Dig Dis Sci 2012; 57: 535–544.

Laing EM, Tripp RA, Pollock NK, Baile CA, Della-Fera MA, Rayalam S și colab. Adenovirus 36, adipozitate și rezistență osoasă la femeile adolescente târzii. J Bone Miner Res 2013; 28: 489–496.

Dhurandhar NV. Acțiunea de economisire a insulinei a adenoirusului 36 și a acestuia E4orf1 proteină. J Complicații ale diabetului 2013; 27: 191-199.

Choi Y, Chang J. Vectorii virali pentru aplicarea vaccinului. Clin Exp Vaccine Res 2013; 2: 97–105.

Burchill MA, Tamburini BA, Pennock ND, White JT, Kurche JS, Kedl RM. Vaccinologia cu celule T: explorarea necunoscutelor cunoscute. Vaccin 2013; 31: 297–305.

Lee SG, Jin JY, Kwon BM, Park SW, Paik SY. Inactivarea virusului pandemic al gripei umane A H1N1 din 2009 prin fotocatalizator sub iradiere UV. J Bac Virol 2012; 42: 83-85.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de un grant acordat de GRRC al Universității Catolice din Coreea și de Programul de cercetare științifică de bază al Fundației Naționale de Cercetare din Coreea (NRF) finanțat de Ministerul Educației, Științei și Tehnologiei (2012R1A1A2039819).

Informatia autorului

Afilieri

Departamentul de Biotehnologie, Universitatea Catolică din Coreea, Bucheon, Coreea

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar