Divizia de afiliere a biologiei celulelor tumorale, Institutul de Cercetare Beckman din Orașul Speranței, Duarte, California, Statele Unite ale Americii

protectoare

Divizia de afiliere a biologiei celulelor tumorale, Institutul de Cercetare Beckman din Orașul Speranței, Duarte, California, Statele Unite ale Americii

Divizia de afiliere a bioinformaticii, Institutul de cercetare Beckman din City of Hope, Duarte, California, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru patologie, Institutul de cercetare al orașului Hope, Duarte, California, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru biologie moleculară și celulară; Institutul de cercetare Beckman din City of Hope, Duarte, California, Statele Unite ale Americii

Divizia de afiliere a biologiei celulelor tumorale, Institutul de cercetare Beckman al orașului Hope, Duarte, California, Statele Unite ale Americii, Divizia de bioinformatică, Institutul de cercetare Beckman al orașului Hope, Duarte, California, Statele Unite ale Americii, Departamentul de patologie, Institutul de Cercetare al Orașului Speranței, Duarte, California, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Biologie Moleculară și Celulară; Institutul de cercetare Beckman din City of Hope, Duarte, California, Statele Unite ale Americii

  • Noriko Kanaya,
  • Makoto Kubo,
  • Zheng Liu,
  • Peiguo Chu,
  • Charles Wang,
  • Yate-Ching Yuan, Shiuan Chen

Cifre

Abstract

Citare: Kanaya N, Kubo M, Liu Z, Chu P, Wang C, Chen Y-CYS (2011) Efectele protectoare ale ciupercilor cu buton alb (Agaricus bisporus) împotriva steatozei hepatice la șoarecii ovariectomizați ca model al femeilor aflate în postmenopauză. PLOS ONE 6 (10): e26654. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026654

Editor: Franky L. Chan, Universitatea chineză din Hong Kong, Hong Kong

Primit: 31 august 2011; Admis: 30 septembrie 2011; Publicat: 25 octombrie 2011

Finanțarea: Această activitate a fost susținută de subvenții obținute de SC de la Institutul Național de Sănătate (ES08258) și de la Consiliul SUA pentru Ciuperci și Asociația Australiană a Cultivatorilor de Ciuperci (SC). Finanțatorii nu au avut nicio regulă în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscriselor.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) este cea mai frecventă boală hepatică la adulții din țările dezvoltate [1]. Se caracterizează prin acumularea excesivă de lipide hepatice și nu are legătură cu consumul de alcool. NAFLD include diverse patologii hepatice, de la steatoza hepatică la steatohepatita nealcoolică (NASH), fibroză și ciroză. NAFLD este asociat cu sindromul metabolic, care a fost caracterizat prin obezitate, diabet de tip 2, hipertensiune arterială și hipertrigliceridemie la șoareci [1], [2]. De asemenea, ciroza este un factor de risc pentru dezvoltarea hipertensiunii portale, a carcinomului hepatocelular și a insuficienței hepatice [1]. S-a sugerat că estrogenul oferă un efect protector asupra dezvoltării NAFLD la femei [3]. Prin urmare, femeile aflate în postmenopauză prezintă un risc mai mare de a dezvolta NAFLD datorită unui nivel mai scăzut de estrogen circulant [3]. Datorită duratei medii de viață crescute, generațiile actuale de femei se pot aștepta să își petreacă cel puțin o treime din viață în starea postmenopauză [4]. Liniile directoare dietetice și stilul de viață pentru a reduce greutatea corporală totală pot ajuta la evitarea NAFLD, cu toate acestea, nu există medicamente specifice pentru tratarea acestei boli hepatice [5].

Materiale și metode

Pregătirea dietei WBM

WBM au fost liofilizate la un conținut de umiditate constant și apoi măcinate printr-o plasă fină. Măsurători microbiologice și alte măsurători analitice au fost efectuate pe probe/loturi combinate pentru a asigura calitatea pulberii WBM pentru cercetare. HFD martor (45% (greutate/greutate) dietă grasă) și HFD modificat pentru a conține pulbere WBM liofilizată au fost produse și achiziționate de la Research Diets, Inc. (New Brunswick, NJ) (Tabelul 1). Pentru un studiu de dovadă a conceptului pentru a furniza date definitive, dieta a fost compusă din 120 g de pulbere WBM/kg de HFD, o doză similară cu cea utilizată anterior pentru a evalua efectul dietei cu ciuperci Mukitake pentru NAFLD [9]. Mai mult, această doză terapeutică de WBM s-a dovedit că suprimă creșterea cancerului de sân dependent de estrogen și aromatază pozitivă în laboratorul nostru, utilizând un model de șoareci nud [10].

Design experimental pentru mouse

Toate procedurile de cercetare a animalelor au fost aprobate de comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) din City of Hope pentru evaluarea și acreditarea îngrijirii animalelor de laborator și au fost în conformitate cu orientările NIH. Tulpina de reproducție C57Bl/6J a fost obținută de la Jackson Labs. Toate animalele au fost adăpostite la Centrul de Resurse Animale City of Hope în rafturi cușcă ventilate, au avut acces gratuit la apă și au fost întreținute pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Au fost respectate toate orientările instituționale pentru îngrijirea și utilizarea animalelor. Protocolul pentru acest studiu a fost aprobat de IACUC (numărul protocolului: 08047).

Pentru a crea un model de șoarece de femei aflate în postmenopauză, șoarecii C57B1/6J femele în vârstă de șapte săptămâni au fost ovariectomizate (OVX, n = 16). Acești șoareci OVX produc doar estrogen din situri extragonadale și sunt folosiți pe scară largă ca model al femeilor aflate în postmenopauză [4], [15]. Șoarecii martor (fals, n = 16) au fost supuși unei intervenții chirurgicale de supraviețuire. Șoarecii fals au fost supuși aceleiași proceduri chirurgicale generale ca șoarecii OVX, cu excepția îndepărtării ovarelor. Șoarecii au fost apoi împărțiți în două grupuri dietetice, cu opt șoareci per grup: HFD sau HFD + WBM. Dietele au fost începute la o săptămână după operație și au continuat timp de 3 luni. Proiectul de hrănire a perechii a fost utilizat pentru a controla aportul de alimente. Alimentele au fost cântărite zilnic, iar grupul de control a primit aceeași cantitate de alimente (în greutate) o zi mai târziu ca grupul WBM pentru a asigura un aport caloric identic între grupuri. La încheierea experimentului, șoarecii au fost posti timp de 4 ore înainte de sacrificiu. Sângele șoarecilor a fost colectat prin puncție cardiacă. După ce șoarecii au fost eutanasiați, s-au recoltat probe de ficat.

Analiza patologică

Ficăcii au fost recoltați de la șoareci și au fost măsurate greutățile umede. Țesuturile au fost fixate cu 10% formalină peste noapte și apoi încorporate în parafină. Secțiunile de cinci micrometri au fost tăiate și colorate cu hematoxilină și eozină și examinate cu microscopul luminos.

Măsurarea enzimelor hepatice

Probele de sânge au fost colectate la sfârșitul fiecărui experiment prin puncție cardiacă și centrifugate la 4000 rpm timp de 10 minute pentru a obține ser. Nivelurile serice de alanină aminotransferază (ALT) au fost măsurate de compania de diagnosticare Antech (Irvine, CA).

Test de toleranță la glucoză

Testele de toleranță la glucoză au fost efectuate la 2 luni după începerea dietei de tratament. Șoarecii au fost posti cu acces gratuit la apă potabilă timp de 18 ore înainte de test. Nivelurile inițiale de glucoză au fost înregistrate pentru fiecare șoarece. Șoarecii au fost provocați cu o cantitate de glucoză de 1,5 mg glucoză/g greutate corporală. Nivelurile de glucoză pre, 30, 60, 120 și 180 min după injectare au fost măsurate cu ajutorul unui glucometru (Bayer, Germania).

Analiza microarray

Prelucrarea statistică a datelor Microarray

Măsurătorile de intensitate brută ale tuturor seturilor de sonde au fost corectate pentru fond, normalizate și transformate în măsurători de expresie la nivel de transcriere utilizând metoda IterPlier din Affymetrix Power Tools (versiunea 1.8.6). Evaluarea calității și analiza statistică a datelor privind expresia genei au fost efectuate folosind pachetele R/Bioconductor. Pentru a asigura calitatea înaltă a procesului de microarray, un set de pași de evaluare a calității implementați în pachetul Bioconductor Array Tools (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ArrayTools.html) au fost aplicați la date. ArryTools a fost apoi folosit pentru a identifica genele exprimate diferențial între probele OVX și OVX + WBM. Genele cu expresie semnificativ diferențială au fost selectate utilizând limite de valoare p de 0,05 și o schimbare de 2 ori a nivelului de expresie. Genele care au exprimat modificarea expresiei au fost clasificate și investigate în continuare prin analiza îmbogățirii pe baza componentelor lor celulare, a proceselor biologice, a funcțiilor moleculare și a căilor canonice utilizând software-ul Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Versiunea 9.0) (Ingenuity). Datele sunt compatibile cu MIAME și datele brute au fost depuse în NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) cu numărul de acces GSE31854.

Analiza căii de ingeniozitate (IPA)

Western blot

Celulele HepG2 au fost însămânțate în vase de 60 mm la o densitate de 8 × 105 celule/vas și tratate fie cu controlul vehiculului, cu agonistul receptorului ficatului X (LXR) T0901317 (Cayman CHEMICAL, Ann Arbor, MI) (10 µM), fie cu diferite concentrații de extract WBM timp de 48 de ore. Proteinele au fost izolate din celulele HepG2 folosind tampon de liză pasiv (Promega, Fitchburg, WI). Țesuturile hepatice au fost colectate la sfârșitul experimentului și apoi lizate folosind reactivul de extracție a proteinelor tisulare T-PER (Thermo Scientific, Waltham, MA) conform protocolului producătorului. Pe scurt, țesuturile hepatice au fost cântărite și omogenizate în reactiv T-PER care conține protează și cocktail inhibitor de fosfatază (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) folosind omogenizatorul de țesut de bază T25 (IKA Works, Inc., Wilmington, NC). Atât pentru liza țesuturilor, cât și pentru celula, probele au fost centrifugate la 10.000 X g timp de 5 minute și supernatantul a rulat pe un gel de acrilamidă 12%, a fost transferat la o membrană de nitroceluloză și a fost testat cu anticorpi împotriva FAS (Abcam, Cambridge, MA), ELOVL6, Taipei City, Taiwan) sau β-actină (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). Benzile au fost vizualizate prin chemiluminiscență utilizând anticorpi secundari conjugați cu HRP și cuantificate utilizând software-ul BioRad Quantity One.

Testul genei reporter

Celulele HepG2 au fost placate în plăci cu 24 de godeuri la o densitate de 8 × 105 celule/godeu și tratate fie cu extract DMSO, fie cu WBM. Pentru a evalua efectele WBM asupra activității LXR, celulele HepG2 au fost transfectate tranzitoriu cu rCYP7A-DR-4x3-tk-LUC pCMX-VP16-hLXRα și LXR cu ajutorul sistemului reactiv Lipofectamine Plus (Invitrogen) conform protocolului producătorului. La 24 de ore după transfecție, celulele au fost tratate cu compusul T0901317 (10 uM) singure sau în combinație cu extract WBM (1, 2 și 5 ui/ml) timp de 24 de ore. Pentru evaluarea efectelor WBM asupra activității ER, celulele HepG2 au fost transfectate tranzitoriu cu pSG5-ER și pGL3 (ERE) 3-Luc folosind sistemul reactiv Lipofectamine Plus (Invitrogen). 24 de ore după transfecție, celulele au fost tratate cu 17β-estradiol (E2) (Sigma-Aldrich) (0,1 nM) sau cu extract de WBM (5 și 10 μl/ml) timp de 24 de ore. Lizatul celular a fost colectat folosind tampon de liză pasiv și activitatea luciferazei testate pe un luminometru TD 20/20 (Turner Designs, Sunnyvale, CA). Concentrația de proteine ​​a fost testată utilizând testul BCA (Thermo scientific). Datele sunt exprimate ca conținut relativ de unitate de luciferază/proteină.

Producerea extractului de ciuperci brute

Ca un control împotriva anchetei WBM, am făcut și o analiză a altor tipuri de ciuperci într-o formă de extract de ciuperci. Extractul de ciuperci a fost produs prin tocat 60 g de ciuperci proaspete (WBM, ciuperci shiitake (Lentinus edodes), ciuperci enoki (Flammulina velutipes) sau ciuperci de stridii (Pleurotus ostreatus)) și fierberea ciupercii tocate în 500 ml de apă. Bulionul a fost filtrat și centrifugat la 5.000 rpm timp de 30 de minute. Supernatantul a fost evaporat prin rotor până când volumul final a fost de 6 ml.

Fracționarea extractului de WBM

Extractul WBM brut a fost încărcat la coloane de poliamidă cu capacitate de 5 g/60 ml (Discovery DPA-6S SPE; Supelco). Fluxul prin fracțiune a fost realizat din extractul care a ieșit din coloanele de poliamidă după ce s-a încărcat extractul brut de WBM. Fracțiile au fost eluate printr-un gradient de etapă (50 ml din fiecare etapă) de creștere a metanolului în apă. Fluxul, fracțiile 0%, 20%, 40%, 60%, 80% și 100% metanol-apă au fost evaporate prin rotor până la uscare și apoi redizolvate în 6 ml de DMSO 50%. Prin urmare, 60 g de WBM pot produce 6 ml din fiecare fracție.

Testarea aromatazei microsomale placentare

analize statistice

Pentru compararea celor 2 diete (HFD și HFD + WBM) utilizate în experimentul in vivo, s-a efectuat un test t. Experimentul în timp (greutatea corporală) a fost analizat cu ANOVA cu 2 factori. Pentru comparații multiple, analiza a fost urmată de compararea tuturor grupurilor de tratament cu grupul de control (testul lui Dunnett) sau de compararea tuturor perechilor de tratament (testul lui Tukey). Semnificația statistică a fost definită ca P Figura 1. Efectele hrănirii WBM asupra greutății corporale, a greutății ficatului, a nivelurilor serice ALT și a greutății uterului.

Șoarecii C57B1/6J femele în vârstă de șapte săptămâni au fost ovariectomizate. Acești șoareci sunt un model de femei în postmenopauză (OVX, n = 16). Șoarecii martor (fals, n = 16) au fost supuși unei intervenții chirurgicale de supraviețuire. Atât șoarecii fals, cât și șoarecii OVX au fost hrăniți cu o dietă HFD (n = 8/per grup) sau HFD cu dieta WBM (n = 8/per grup) timp de 3 luni. Greutatea corporală a fost măsurată o dată pe săptămână. (A) Măsurarea greutății corporale a șoarecilor fals. (B) Măsurarea greutății corporale a șoarecilor OVX. (C) Greutatea ficatului. (D) nivelurile serice ALT. (E) Greutatea uterului. Valorile sunt exprimate ca eroare medie și standard pentru 8 șoareci. * Semnificația statistică a fost definită ca P Figura 2. Aportul de WBM a scăzut acumularea de grăsimi în ficat și a îmbunătățit capacitatea de eliminare a glucozei la șoarecii OVX.

(A) Aspect macroscopic al ficatului de la șoareci hrăniți cu HFD și HFD + WBM timp de 3 luni în fiecare grup fals și OVX. Țesuturile au fost fixate cu 10% formalină peste noapte și apoi încorporate în parafină. Secțiunile de cinci micrometri au fost tăiate și colorate cu hematoxilină și eozină și examinate cu microscopul luminos. Sunt prezentate colorarea reprezentativă a ficatului din fiecare grup. (B) Concentrația serică de glucoză după injecția de glucoză la șoareci hrăniți cu dietă HFD sau HFD + WBM timp de 2 luni. Șoarecii au fost provocați cu 1,5 mg glucoză/g greutate corporală încărcătură de glucoză. Nivelurile de glucoză pre, 30, 60, 120 și 180 min după injectare au fost măsurate cu ajutorul unui glucometru. Valorile sunt exprimate ca eroare medie și standard pentru 8 șoareci. * Semnificația statistică a fost definită ca P Figura 3. Modificări ale metabolismului lipidic în ficat identificate prin analiza microarray și confirmate folosind PCR în timp real.

(A) Măsurătorile de intensitate brută ale tuturor seturilor de sonde au fost corectate pentru fundal, normalizate și transformate în măsurători de expresie la nivel de transcriere utilizând metoda IterPlier din Affymetrix Power Tools. Numărul a indicat modificările ori ale expresiei genei în OVX + WBM comparativ cu OVX. (B) Expresii ARNm Fas și Elovl6 în țesuturile hepatice de la șoareci din fiecare grupă de tratament (Sham HFD, Sham HFD + WMB, OVX HFD și OVX HFD + WBM) prin analiză PCR în timp real. Expresia genică a fost normalizată cu gena de menaj β-actină. Valorile sunt exprimate ca eroare medie și standard pentru 8 șoareci. * Semnificația statistică a fost definită ca P Figura 4. Modificări ale nivelului de ARNm și proteine ​​ale genelor legate de calea de sinteză a acizilor grași în celulele HepG2 tratate cu extract WBM.

Celulele au fost incubate cu controlul vehiculului (etanol), T0901317 (10 uM) și/sau extract WBM (1 și 5 ui/ml) timp de 24 de ore pentru ARN și respectiv 48 de ore pentru proteine. (A) Nivelurile de ARNm FAS și ELOVL6. Expresia genică a fost normalizată cu gena de menaj β-actină. (B) Expresiile proteinei FAS au fost determinate prin western blot. Graficele cu bare indică cuantificarea a trei pete separate folosind software-ul Quantity One. Valorile sunt exprimate ca eroare medie și standard. (C) niveluri de ARNm SREBP1. Am analizat datele pentru fiecare doză separat de ANOVA, urmat de testul de comparație multiplu al lui Tukey. Semnificația statistică a fost definită ca * P Figura 5. Efectele fracțiilor de metanol din extractul WBM asupra expresiilor genei FAS și ELOVL6 și a activității aromatazei în celulele HepG2.

Celulele au fost incubate cu fiecare fracție de metanol din extract WBM timp de 24 de ore. (A) Expresia genei FAS și ELOVL6 a fost normalizată cu gena de menținere a β-actinei. (B) S-au efectuat teste microscomice pentru a evalua efectele anti-aromatazice ale WBM utilizând substratul, [1-β-3H] androstendionă. Activitatea a fost calculată pentru a măsura supernatantul care conține [3H] H20 ca produs de reacție și apoi a fost numărat într-un contor de scintilație. Activitatea de inhibare a aromatazei a fost calculată ca procent de activitate rămasă din reacție fără fracții de ciuperci. Analizele au fost efectuate în trei exemplare și datele au fost exprimate ca medie ± SE. Am analizat datele pentru fiecare tratament de către ANOVA, urmate de compararea tuturor grupurilor de tratament cu grupul de control (testul lui Dunnett). Semnificația statistică a fost definită ca P 0,05) (Figura 6A). Aceste rezultate sugerează prezența antagonistilor LXR în extractul WBM. Folosind o linie celulară MCF7 ER pozitivă, activitatea reporterului ER-luciferază a fost semnificativ crescută prin tratamentul E2 (P Figura 6. Activitatea LXR și ER în celulele HepG2 tratate cu extract WBM.

(A) Celulele HepG2 au fost transfectate cu pCMX-VP16-hLXRa și rCYP7A-DR-4x3-tk-LUC care răspund LXR și următoarele au fost incubate cu controlul vehiculului (etanol), T0901317 (10 µM) și/sau extract WBM (1, 2 și 5 μl/ml) și testat pentru activitatea luciferazei. (B) Pentru evaluarea efectelor WBM asupra activității ER, celulele HepG2 au fost transfectate tranzitoriu cu pSG5-ER și pGL3 (ERE) 3-Luc. La 24 de ore după transfecție, celulele au fost tratate cu E2 (0,1 nM) sau cu extract WBM (5 și 10 pl/ml) timp de 24 de ore. Datele sunt exprimate ca conținut relativ de unitate de luciferază/proteină. Valorile sunt exprimate ca eroare medie și standard. Pentru activitatea LXR, am analizat datele pentru fiecare doză separat de ANOVA, urmat de testul de comparație multiplu al lui Tukey. * P Figura 7. Compararea efectelor diferitelor specii de ciuperci asupra căii de sinteză a acizilor grași.