Facultatea de Medicină, Departamentul de Obstetrică și Ginecologie, Universitatea Texas Tech Centrul de Științe ale Sănătății din bazinul Permian, Odessa, Texas

efectul

Departamentul de Științe Animale, Universitatea din Wyoming, Laramie, Wyoming

Texas Biomedical Research Institute și Southwest National Primate Research Center, San Antonio, Texas

Școala de farmacie, Texas Tech University Health Science Center, Amarillo, Texas

Universitatea din Alabama la Birmingham, Birmingham, Alabama

Facultatea de Medicină, Departamentul de Obstetrică și Ginecologie, Centrul de Științe de Sănătate al Universității Texas Tech din bazinul Permian, Odessa, Texas

Școala de farmacie, Texas Tech University Health Science Center, Amarillo, Texas

Institutul de Cercetări Clinice, Texas Tech University Health Sciences, Lubbock, Texas

Facultatea de Medicină, Departamentul de Obstetrică și Ginecologie, Universitatea Texas Tech Centrul de Științe ale Sănătății din bazinul Permian, Odessa, Texas

Facultatea de Medicină, Departamentul de Obstetrică și Ginecologie, Universitatea Texas Tech Centrul de Științe ale Sănătății din bazinul Permian, Odessa, Texas

Facultatea de Medicină, Departamentul de Obstetrică și Ginecologie, Universitatea Texas Tech Centrul de Științe ale Sănătății din bazinul Permian, Odessa, Texas

Departamentul de Științe Animale, Universitatea din Wyoming, Laramie, Wyoming

Texas Biomedical Research Institute și Southwest National Primate Research Center, San Antonio, Texas

Facultatea de Medicină, Departamentul de Obstetrică și Ginecologie, Universitatea Texas Tech Centrul de Științe ale Sănătății din bazinul Permian, Odessa, Texas

Adresa pentru solicitări de reimprimare și alte corespondențe: N. Schlabritz-Lutsevich, Dept. de obstetrică și ginecologie, depart. of Pharmacology and Neuroscience, Texas Tech University Health Sciences Center la Permian Basin School of Medicine, 800 W. 4th St., Odessa, TX 79763 (e-mail: [e-mail protejat]).

Abstract

Îngrijirea animalelor

Pentru a produce obezitate, babuinii cu greutate normală (Papio spp.) au fost hrăniți cu o dietă de 45% grăsimi (HFD; n = 11) ad libitum, în timp ce controalele (CTR; n = 11) au consumat 12% grăsimi timp de ≥ 9 luni înainte de concepție și în timpul sarcinii. Compoziția dietetică este descrisă în detaliu în altă parte (53, 57). Animalele au fost adăpostite într-un mediu controlat în aer liber, în cuști sociale de 14-16 femele și un bărbat cu activitate fizică și socială completă (33). Cezarianele au fost efectuate sub anestezie generală la 0,9 zile de gestație (165 dGA), așa cum s-a descris anterior (57). Țesuturile fetale, placentare și materne au fost colectate și conservate fie prin fixarea formalinei (pentru imunohistochimie), fie prin congelare în azot lichid și depozitare la -80 ° C pentru cuantificarea proteinei/ARN-ului. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Centrul Național de Cercetare a Primatelor din Sud-Vest (protocolul nr. 1244PC).

Estimarea concentrațiilor de 2-arahidonoil glicerol și anandamidă în serul fetal și matern utilizând cromatografie lichidă-spectrometrie de masă/spectrometrie de masă

Transcriere inversă în timp real PCR cantitativ

Imunohistochimie

Western Blotting

Analize statistice

Toate datele sunt rezumate ca medii ± SE. Testele lui Shapiro-Wilk și Levene au fost utilizate pentru a evalua normalitatea și, respectiv, egalitatea varianței. Deoarece variabile multiple nu au îndeplinit criteriile pentru o analiză a varianței 2 × 2 datorită distribuțiilor nenormale și a dimensiunilor foarte mici ale eșantioanelor, extensia nonparametrică Scheirer-Ray-Hare a testului Kruskal-Wallis a fost utilizată pentru a analiza efectul dietei (HFD vs CTR), sexul fetal (masculin vs. feminin) și dieta × interacțiunea sexuală. Datele CB1R și CB2R de la IHC au fost analizate folosind aceeași abordare, dar efectele sexului fetal și interacțiunea dietă × sex nu au fost calculate din cauza configurării experimentale IHC. Semnificația a fost stabilită la 0,05.

Morfometrie fetală și maternă

Greutatea fetală a fost influențată de sexul fetal, dar nu de tiparul alimentar matern (Tabelul 1). Creșterea greutății materne la animalele hrănite cu HFD s-a apropiat de semnificație (P = 0,055).

Tabelul 1. Greutățile materne și fetale în grupurile CTR și HFD

Valorile sunt medii ± SE. CTR, control; HFD, dietă bogată în grăsimi; CS, cezariană. Notă: Animalele HFD au fost hrănite cu o dietă de 45% grăsimi, iar CTR au fost hrănite cu o dietă de 12% grăsimi. Deoarece greutățile placentare și hepatice au prezentat valori lipsă, sunt prezentate doar date descriptive pentru aceste variabile. Greutatea CS Mat este greutatea maternă la momentul operației cezariene.

Concentrații circulante de 2-AG și AEA în baraje și fetusurile lor

Concentrațiile materne 2-AG au fost crescute și concentrațiile fetale au scăzut în grupul HFD independent de sexul fetal (Tabelul 2).

Tabelul 2. Concentrațiile de AEA și 2-AG după dietă și sex fetal

Valorile sunt medii ± SE. AEA, anandamidă; 2-AG, 2-arahidonoil glicerol; CTR, control; HFD, dietă bogată în grăsimi.

Expresia sistemului endocannabinoid în placentă și ficat matern și fetal

Sistemul endocannabinoid hepatic matern și fetal.

imunohistochimie.

CB1R a fost exprimat în citoplasmă (diguri) și în membranele celulare (fetuși) ale hepatocitelor periportale care înconjoară vena centrală și epiteliul căilor biliare (Fig. 1). Histoscorele nu au fost diferite între grupurile HFD și CTR. Expresia CB2R a fost evidentă în fibroblastele țesuturilor conjunctive ale triadei, ale căilor biliare, ale hepatocitelor pericentrale și ale pereților arteriali (Fig. 2), iar histoscorele nu au fost diferite între grupurile HFD și CTR.

FIG. 1.Expresia proteinei receptorului endocannabinoid 1 (CB1R) în ficatul matern și fetal al unei diete bogate în grăsimi (HFD); n = 11) și control (CTR; n = 10) animale. A-D: imagini reprezentative ale ficatului fetal de la fetuții masculi (MF) în CTRn = 3) și HFD (n = 6) grupuri. E-H: ficatul fetal de la fetuții feminini (FF) în CTR (n = 6) și HFDn = 3) grupuri. Eu-L: ficatul matern al barajelor cu MF în CTR (n = 4) și HFD (n = 5) grupuri. M-P: secțiuni de ficat matern de la baraje care transportă FF în CTR (n = 5) și HFDn = 4) grupuri. Î-T: analize cantitative. Săgețile albastre indică căile biliare, săgețile verzi indică arterele, săgețile roz indică venele centrale (CV), iar asteriscurile galbene indică vena portă. Controalele negative (omiterea anticorpilor primari) sunt prezentate în A-P, insecte (sus în dreapta). Bare de scară, 20 μm. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE. Triada portală este definită de vena portală, conducta biliară și artera hepatică.


FIG. 2.Expresia proteinei receptorului endocannabinoid 2 (CB2R) în ficatul matern și fetal al unei diete bogate în grăsimi (HFD); n = 11) și control (CTR; n = 10) animale. A-D: imagini reprezentative ale ficatului fetal de la fetuții masculi (MF) în CTRn = 3) și HFD (n = 6) grupuri de diete. E-H: ficatul fetal de la fetusii feminini (FF) în CTR (n = 4) și HFD (n = 4) grupuri. Eu-L: ficatul matern al barajelor cu MF în CTR (n = 3) și HFD (n = 5) grupuri. M-P: secțiuni de ficat matern de la baraje care transportă FF în CTR (n = 5) și HFDn = 4) grupuri. Î-T: analize cantitative. Săgețile albastre indică căile biliare, săgețile verzi indică arterele, săgețile roz indică venele centrale (CV), iar asteriscurile galbene indică vena portă. Controalele negative (omiterea anticorpilor primari) sunt prezentate în A-P, insecte (sus în dreapta). Bare de scară, 20 μm Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE.

analize rt-pcr și western blot.

Expresia produsului genetic a fost similară între toate grupurile (Tabelul 3). Analizele Western blot au arătat că, comparativ cu dieta de control, expresia CB1R (receptor de lungime completă, 55 kDa) a crescut la barajele HFD care transportă fetuși masculi cu 40% și au scăzut la fetuți cu 75% (Tabelul 3). Expresia isoformelor lungi de CB1R a fost scăzută și sub limita de detecție în barajele HFD și fetusii lor feminini. Expresia hepatică maternă CB2R, FAAH-1, MAGL și COX-2 a fost similară între grupuri. Expresia fetală a CB2R, FAAH și COX-2 a fost scăzută atât la fetuții masculini, cât și la cei feminini, iar expresia DAGLα a scăzut la fetuții masculini din grupul HFD comparativ cu cea din fetuții grupului CTR. Expresia proteinei MAGL fetale hepatice nu a diferit între grupurile HFD și grupul martor (Fig. 3 și Tabelul 3).

Tabelul 3. Expresia hepatică fetală și maternă a principalilor receptori endocannabinoizi și a enzimelor metabolizante la fetuții masculi și feminini în apropierea termenului de mamă HFD și CTR

Valorile sunt medii ± SE. CTR, control; HFD, dietă bogată în grăsimi; CB1R, receptor 1 endocannabinoid; CB2R, receptor 2 endocannabinoid; FAAH, amida acidului gras hidrolază-1; DAGLA, diacilglicerida lipazei A; MAGL, monoacilglicerol lipaza; COX-2, ciclooxigenaza-2. Toate P valorile au fost calculate utilizând extensia Scheirer-Ray-Hare a testului Kruskal-Wallis cu 1 grad de libertate. Expresiile proteinelor au fost evaluate prin analize Western blot, transcrieri prin RT-PCR cantitativă.

FIG. 3.Expresia proteinelor de CB1R, CB2R, amidă acidă grasă hidrolază-1 (FAAH), diacilgliceridă lipază A (DAGLα), monoacilglicerol lipază (MAGL) și ciclooxigenază-2 (COX-2) în ficat și placentă. A: imaginea Western blot a CB1R, CB2R, FAAH, MAGL și COX-2 în ficatul matern (n = 3-6). B: imaginea Western blot a CB1R, CB2R, FAAH, DAGLα, MAGL și COX-2 în ficatul fetal (n = 4-6). C: imaginea analizei Western blot (CB1R, CB2R, FAAH, DAGL, MAGL și COX-2) în placentăn = 4-6). CTR, control; HFD, dietă bogată în grăsimi; MF, făt mascul; FF, făt feminin; M, bărbat; F, femeie.

Expresia sistemului endocannabinoid placentar.

imunohistochimie.

CB1R a fost exprimat în citotrofoblaste (CT) și în nucleul vilos și capilarele fetale (FC) ale grupului CTR și în sinciotrofoblastul (ST), CT și capilarele fetale din grupul HFD. CB2R a fost exprimat în ST și CT ale ambelor grupuri (Fig. 4). Histoscorurile pentru grupurile HFD și CTR au fost similare.

FIG. 4.Expresia proteinelor CB1R și CB2R în placentă dintr-o dietă bogată în grăsimi (HFD; n = 10) și control (CTR; n = 11) animale. A, B, E, și F: expresia placentară a CB1R la fetuții masculini (MF). C, D, G, și H: imagini reprezentative ale secțiunilor placentare de la făturile feminine (FF). Săgețile albastre indică sincitiotrofoblasti, săgețile verzi indică citotrofoblastele, iar săgețile roz indică capilarele fetale. Controalele negative (omiterea anticorpilor primari) sunt prezentate ca insecte (A-H, sus în dreapta). Bara de scalare, 20 μm. Eu-L: cuantificări imunohistochimice pentru grupurile HFD și CTR. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE.

analize rt-pcr și western blot.

Expresia genică nu a diferit între cele două grupuri. Expresia proteinei CB2R a crescut la fetuții masculi și a scăzut la fetușii feminini din barajele HFD (Tabelul 4).

Tabelul 4. Expresia placentară a principalilor receptori endocannabinoizi și a enzimelor metabolizante în placentele fetușilor de sex masculin și feminin în apropierea termenului de mamă HFD și CTR

Valorile sunt medii ± SE. CTR, control; HFD, dietă bogată în grăsimi; CB1R, receptor 1 endocannabinoid; CB2R, receptor 2 endocannabinoid; FAAH, amida acidului gras hidrolază-1; DAGLA, diacilglicerida lipazei A; MAGL, monoacilglicerol lipaza; COX-2, ciclooxigenaza-2. Toate P valorile au fost calculate utilizând extensia Scheirer-Ray-Hare a testului Kruskal-Wallis cu 1 grad de libertate. Expresiile proteinelor au fost evaluate prin analize Western blot, transcrieri prin RT-PCR cantitativă.

Răspunsuri ECS sistemice și hepatice materne la HFD

Concentrațiile plasmatice de AEA au fost identificate recent ca markeri ai NAFLD la populația umană (44). Cu toate acestea, selecția pacienților din populația umană a fost făcută pe baza criteriilor histologice NAFLD, în timp ce selecția experimentală în studiul nostru s-a bazat pe expunerea la HFD. În modelul nostru animal (Papio spp.), expunerea animalelor adulte care nu sunt gravide la 7-14 săptămâni de HFD a fost asociată cu hiperlipidemie și inflamație (48, 72), care sunt trăsături ale sindromului metabolic la om, care în cele din urmă ar putea duce la NAFLD (2). În general, la populația umană, obezitatea morbidă a fost asociată cu steatoză hepatică la 88% din grupul studiat, cu o vârstă medie de 43,1 ani (73).

Răspunsul ECS placentar la un HFD

În modelele de cultură celulară in vitro, steatoza indusă de acid oleic a fost asociată cu reglarea descendentă a genei CB2R (21). În mod interesant, în studiul nostru, am observat diferențe dependente de sexul fetal în efectul unei HFD asupra expresiei CB2R placentare; a fost suprareglementată la bărbați și reglată în jos la fetuții feminini. În acord cu datele noastre, absorbția acidului oleic a fost cu 43% mai mică la descendenții masculi și cu 73% mai mare la descendenții feminini ai femeilor obeze decât la femeile neobeze (11). CB2R a fost exprimat în ST și CT în placentă, care joacă un rol important în metabolismul acizilor grași (46).

Disfuncția endotelială este semnul distinctiv al sarcinilor complicate de MO (62, 74). Localizarea CB1R în endoteliul placentar fetal este în acord cu datele publicate anterior în babuin (13) și în placenta umană (34). În studiul de față, expresia CB1R a fost localizată în principal în endoteliul vascular fetal al animalelor CTR, iar hrănirea maternă cu HFD a mutat această expresie către ST. În endoteliu, CB1R este implicat în relaxarea vasculară (75). Trecerea expresiei CB1R la stratul exterior al ST-urilor din grupul HFD ar putea fi asociată cu activitatea crescută a lipoproteinei lipazei (LPL) în ST-urile din MO (66) deoarece activitatea LPL este reglată printr-un mecanism legat de CB1R (20). Astfel, este posibil ca într-un HFD, efectul eCB să poată fi mutat de la răspunsurile vasculare la cele metabolice. O altă explicație a schimbării CB1R ar putea fi asociată cu concentrațiile crescute de lipopolizaharide (LPS) descrise în obezitate (49). În intestin, de exemplu, expresia CB1R este controlată de conținutul de bacterii intestinale (55), iar LPS reglează în sus expresia CB1R (9).

ECB hepatice fetale și consumul matern de HFD

Pe scurt, după cunoștințele noastre, acest studiu este primul raport despre scăderea concentrațiilor de 2-AG sistemică fetală ca răspuns la un HFD. Un ECS matern stimulat de HFD este asociat cu modificări fetale hepatice și placentare în receptorii cheie ECS și enzime metabolice.

Acest studiu a fost susținut de National Institutes of Health Grant HD-21350 către P. Nathanielsz și Texas Tech University Health Sciences Center fonduri de pornire pentru N. Schlabritz-Loutsevitch.

Autorii nu declară conflicte de interese, financiare sau de altă natură.

K.G., C.L., N.G., C.S., M. Carrillo, R.R.K., S.M., M. Chuecos și N.S.-L. efectuat experimente; K.G., P.N. și N.S.-L. interpretarea rezultatelor experimentelor; K.G., C.L., N.G., C.S., R.R.K., E.L., M. Chuecos, G.V., P.N. și N.S.-L. manuscris redactat; K.G., C.L., N.G., C.S., R.R.K., E.L., M. Chuecos, G.V., P.N. și N.S.-L. manuscris editat și revizuit; K.G., C.L., N.G., C.S., M. Carrillo, R.R.K., E.L., S.M., M. Chuecos, G.V., P.N. și N.S.-L. versiunea finală aprobată a manuscrisului; M. Carrillo și N.S.-L. figuri pregătite; E.L. și N.S.-L. date analizate; P.N. și N.S.-L. cercetare concepută și proiectată.

MULȚUMIRI

Recunoaștem ajutorul lui E. Arzate cu imagini și Melissa Wagoner cu editarea manuscriselor. Recunoaștem generozitatea Dr. Charles Burns (Patologie, MCH) și echipa sa pentru sprijin continuu. Mulțumim Dr. Raul Martinez-Zaguilan (TTUHSC), care a furnizat echipamente esențiale de studiu. Recunoaștem ajutorul lui Saloni Cholia (MISD, elev de liceu) cu analizele de imagine.