ABSTRACT

Construirea de biblioteci de ARNr 16S. ADN-ul total individual extras din fluidul galben a fost diluat la o concentrație de 50 ng μl -1 și a fost combinat prin amestecarea a 2 μl din fiecare probă de ADN de la animale eficiente (n = 29) (biblioteca 1) și animale ineficiente (n = 29) bibliotecă 2) pentru construcția bibliotecii. Gena ARNr parțială 16S (~ 800 bp) a fost amplificată cu perechea de primer universal Met 86f/Met 915r (Tabelul 1), utilizând următorul program: o denaturare inițială timp de 5 minute la 94 ° C; 30 de cicluri la 94 ° C timp de 30 s, 57 ° C timp de 30 s și 68 ° C timp de 1 min; și o alungire finală timp de 7 minute la 68 ° C. Soluția de PCR (50 μl) conținea 1 μl de 20 pmol din fiecare primer, 1 μl de 10 mM deoxinucleozid trifosfat, 2,5 U de Taq polimerază (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 × tampon PCR, 1 μl de 50 mM MgCl2, și 1 μl de șablon de ADN colectat. Produsele PCR amplificate au fost apoi clonate în vectorul TOP10 (trusa de clonare TOPO TA; Invitrogen) prin utilizarea transformării chimice. Coloniile cu inserție au fost apoi selectate pe mediu S-Gal (Sigma, St. Louis, MO), iar ADN-ul plasmidic a fost extras folosind un kit de extracție a plasmidei Millipore (Millipore, Billerica, MA).

bovine

Grundurile utilizate în acest studiu pentru a viza genele metanogenului 16S rARN

Secvențierea și analiza filogenetică. Din bibliotecile 1 și 2, respectiv 624 și 672 de clone au fost selectate aleatoriu și supuse analizei secvenței cu un sistem de secvențiere ABI 3730, folosind un kit de secvențiere a ciclului ABI PRISM BigDye Terminator versiunea 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) Reacția de secvență a fost efectuată cu 10 μl de soluție conținând 0,5 μl BigDye, 3,2 pmol de M13 Forward (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC) sau primer M13 Reverse (TTCACACAGGAAACAGCTATGAC), 2,0 μl de tampon de secvențiere 5 × și 20 ng de ADN plasmidic ca șablon. Toate secvențele au fost supuse căutărilor BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) pentru a determina cel mai apropiat taxon cunoscut și au fost aliniate utilizând programul ClustalW (http://www.ebi.ac. uk/Tools/clustalw2 /). Analiza filogenetică a fost efectuată utilizând metoda de îmbinare vecină cu pachetul PHYLIP (versiunea 3.67) (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). Numerele de bootstrap obținute de la 1.000 de replici au fost alocate lângă noduri pentru a verifica gruparea secvențelor.

Analiza clonării bibliotecii. Bibliotecile obținute au fost apoi analizate folosind programul Mothur (Mothur v1.3.0, http://www.mothur.org/wiki/Main_Page) prin compararea unităților taxonomice operaționale (OTU) pe baza 97% similitudine între secvențe. Matricile de distanță au fost calculate utilizând programul DNADIST din pachetul software PHYLIP. Analiza de rarefacție a structurii bibliotecii a fost realizată pe baza principiului din programul DOTUR (28). Indicii diversității, cum ar fi indicele Shannon, indicele Simpson și indicele Chao1, au fost folosiți pentru a măsura diversitatea fiecărei biblioteci. Diferențele dintre biblioteci au fost analizate prin compararea nivelurilor de acoperire a eșantioanelor, a similitudinilor apartenenței la comunitate (indicele Ochiai) și a structurilor comunității (indicele Bray-Curtis) pe baza principiului din programul ∫-LIBSHUFF (27). Diversitatea comunității a fost comparată într-un context filogenetic, utilizând testul de semnificație UniFrac și testul P în cadrul UniFrac (18).

Grundurile utilizate în acest studiu pentru analiza qRT-PCR

Analize statistice. Numerele copiilor și proporțiile speciilor specifice de metanogen au fost obținute de la fiecare individ, iar valoarea medie a fost utilizată pentru analiza statistică. Testul t al studentului a fost utilizat pentru a verifica diferența în fiecare specie vizată de metanogen între animalele L-RFI și H-RFI. Un model mixt de covarianță simplă a fost utilizat pentru a corela populația de metanogen cu producția de acizi grași volatili și RFI utilizând sistemul SAS (versiunea 9.1; Institutul SAS, Cary, NC). Semnificația a fost definită la valorile P ale numerelor de acces la secvența nucleotidică. Secvențele de nucleotide generate din această lucrare au fost depuse în GenBank sub numerele de acces FJ579097 la FJ580045.

REZULTATE

Comparație de secvențe generate din biblioteci de clone 16S. Pentru a identifica profilurile de metanogen din rumen, s-au folosit diferite combinații de primeri metanogeni universali raportați pentru a amplifica produsele genei ARNr 16S complete sau parțiale pentru construcția bibliotecii. Dar încercarea de a genera un fragment complet de ARNr 16S cu combinația de 21F (29) și 1389-1406R (17) așa cum este descris de Ohene-Adjei și colab. (25) nu a avut succes, deși acești primeri au vizat cu succes metanogenii totali din rumenul ovin. Utilizările Met 86f/Met 1340r, așa cum sunt subliniate de Wright și Pimm (39) și combinația exemplară 21F/Met 1340r, nu au putut genera produse PCR de la toate animalele. Doar perechea de exemple Met 86f/Met 915r care vizează un produs parțial al genei ARNr 16S (~ 800 bp) a generat ampliconi din toate cele 58 de probe galbene. Prin urmare, această pereche de exemple a fost utilizată pentru a amplifica ADN-ul galben grupat pentru construirea bibliotecii.

În total, 482 și 490 secvențe au fost obținute din biblioteca 1 (animale L-RFI reunite) și biblioteca 2 (animale H-RFI grupate), respectiv. Din romenurile animalelor L-RFI (biblioteca 1), 478 din 482 secvențe au fost identificate ca fiind metanogene, în timp ce 471 din 490 secvențe au fost identificate ca fiind metanogene din romenurile animalelor H-RFI (biblioteca 2). Secvențele identificate ca fiind nemetanogene, 4 secvențe din biblioteca 1 și 19 secvențe din biblioteca 2, s-au dovedit a aparține a 13 filotipuri bacteriene. Deoarece până la 16 pb din secvențele de exemplu se potrivesc cu aceeași regiune a bacteriilor, nu este surprinzător faptul că primerii metanogeni universali ar putea amplifica și unele grupuri de bacterii. Aceste secvențe nu au fost incluse pentru analiza metanogenă a comunității.

Diagrama OTU-urilor identificate de programul Mothur la nivelul de similaritate de 97% în și între bibliotecile 1 (animale L-RFI) și 2 (animale H-RFI). OTU-urile reprezentative sunt prezentate de numerele de identificare ale clonei, cu numerele de acces GenBank între paranteze.

Comparația diversităților de structură a clonelor secvențiate în biblioteca 1 și biblioteca 2 a

Caracterizarea taxonomiei ecologiei metanogene în rumen. Pentru a evalua diferența identificată în structura comunității dintre cele două biblioteci, taxonomiile tuturor OTU-urilor au fost investigate în continuare printr-o căutare BLAST bazată pe o abordare descrisă de Ben-Dov și colab. (3). Următoarele criterii au fost utilizate pentru a determina taxonomia fiecărei OTU: o potrivire> 97% între secvența clonă și datele GenBank a fost considerată a reprezenta tulpini din nivelul speciei, iar identitatea 93-96% a reprezentat diferite specii la nivelul genului. Toate OTU-urile obținute în acest studiu seamănă cu șapte tulpini din cinci specii cunoscute: Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter thaueri, Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter wolinii și Methanosphaera stadtmanae.

Patru sute doisprezece și 322 secvențe din biblioteca 1 (animale L-RFI) și respectiv biblioteca 2 (animale H-RFI), au fost identice cu M. ruminantium NT7 (AJ009959), care a predominat în ambele grupuri de animale, dar cu diferite distribuții: 89,2% din totalul clonelor din biblioteca 1 și 73,0% din totalul clonelor din biblioteca 2 (Fig. 2). Distribuțiile altor specii au variat, de asemenea, între animalele L-RFI și H-RFI. De exemplu, pentru animalele L-RFI, cinci secvențe seamănă cu Methanobrevibacter sp. tulpina AbM4 și opt secvențe s-au asemănat cu M. stadtmanae, reprezentând 1,0% și, respectiv, 1,7% din secvențele totale (Fig. 2). Pentru bovinele H-RFI, 53 de secvențe s-au asemănat cu Methanobrevibacter sp. tulpina AbM4 și 27 de secvențe s-au asemănat cu M. stadtmanae, reprezentând 10,8% și respectiv 5,7% din secvențele totale, (Fig. 2). M. wolinii-like Methanobrevibacter sp. secvențele tulpina AbM4 nu au fost raportate anterior să apară în galbenul bovin. În plus, distribuțiile diferitelor tulpini au variat între cele două grupuri de animale (datele nu sunt prezentate).

Distribuția speciilor metanogene pe baza secvențelor lor, clasificate ca metanogeni din biblioteca 1 (animale L-RFI) și biblioteca 2 (animale H-RFI). NT7, M. ruminantium NT7; 30Y, Methanobrevibacter sp. tulpina 30Y; AbM4, Methanobrevibacter sp. tulpina AbM4; SM9, M. smithii SM9; PS, M. smithii PS; CW, M. thaueri CW; FM1, Methanobrevibacter sp. tulpina FM1; CSIRO1.33, clone metanobacteriale arheon CSIRO1.33. Axa y arată că procentele de> 70% pentru mai mult de 70% din secvențe au fost secvențe de Methanobrevibacter ruminantium NT7 în ambele biblioteci.

Mai mult, s-a observat variația metanogenilor la nivelul genotipului în cele două biblioteci. De exemplu, s-a observat că numeroase genotipuri din secvențele identificate ca M. ruminantium NT7 au niveluri ridicate de diversitate a polimorfismelor cu un singur nucleotid (SNP). De exemplu, pentru secvențele cu 99% identitate cu tulpina M. ruminantium NT7, 197 secvențe din biblioteca 1 și 163 secvențe din biblioteca 2 au aparținut a 264 de genotipuri. Figura 3 prezintă alinierea a șase secvențe cu 99% identitate cu tulpina M. ruminantium NT7 cu SNP observate în șase locații reprezentative (Fig. 3). Când s-a analizat asocierea dintre genotipuri și RFI de bovine, unele genotipuri au fost detectate numai la animalele L-RFI, în timp ce unele au fost identificate doar la animalele H-RFI. De exemplu, clonele KR-L06-H10, KR-L08-E10 și KR-L06-C11 au fost identificate numai în biblioteca 1 (animale L-RFI), iar clonele KR-H06-H03 și KR-H11-B04 au fost identificate numai în biblioteca 2 (animale H-RFI). Unele genotipuri, de exemplu, clonele KR-H11-H06 (FJ579567) și KR-H11-D04 (FJ579552), au fost identificate în ambele grupuri de animale.

(A) Analiza genotipului tuturor secvențelor cu 99% identitate cu tulpina Methanobrevibacter ruminantium NT7. Barele indică numărul de secvențe ale fiecărui genotip din biblioteca ARNr 16S generată de la animalele L-RFI și H-RFI. Săgețile indică genotipurile care au existat atât la animalele L-RFI, cât și la H-RFI. (B) Exemplu de SNP-uri prezentate în secvențele care aparțin acestei categorii. Poziția cu asterisc reprezintă poziția nucleotidică cu SNP-uri. Baza cu un pătrat indică SNP-urile particulare ale fiecărei secvențe.

Opt metanogeni supuși au fost identificați la nivelul genului pe baza secvențelor cu 93 până la 96% identitate cu cea mai apropiată specie. Aceste OTU pot reprezenta metanogeni ruminali neidentificați. Dintre acestea, secvențele similare cu M. ruminantium NT7-like și M. stadtmanae-like OTUs au fost detectate atât la animalele L-RFI, cât și la H-RFI, în timp ce M. smithii SM9-like, M. smithii PS-like și Methanobrevibacter sp. tulpina OTU asemănătoare cu FM1 a fost detectată numai la animalele L-RFI. Methanobrevibacter sp. tulpina 30Y-like, M. wolinii-like și Methanobacteriales-like OTUs au fost detectate numai la animalele H-RFI (Fig. 2).

Analiza filogenetică a secvențelor de ARNr parțial 16S metanogen obținute în acest studiu. Secvențele reprezentative au fost generate de programul Mothur la un nivel de diferență de 3%. Secvențele GenBank sunt identificate prin numărul de acces. Valorile bootstrap (> 50%) din 1.000 de replicări sunt indicate pe copac. 1, metanococale; 2, Methanosarcinales; 3, Metanomicrobiales; 4, metanobacteriale; ▴, OTU-uri reprezentative care apar în ambele biblioteci; ⋄, OTU reprezentative care apar doar în biblioteca 1 (animale L-RFI); ○, OTU-uri reprezentative care apar doar în biblioteca 2 (animale H-RFI).

Comparația populațiilor de metanogen între animalele L-RFI și H-RFI. Populațiile de metanogeni totali, Methanobrevibacter sp. tulpina AbM4 și M. stadtmanae au fost selectate pentru analiza qRT-PCR pentru a investiga aceste populații la 58 de animale și corelațiile cu RFI. Populațiile medii totale de metanogen la animalele L-RFI și H-RFI au fost de 2,12 × 107 celule ml -1 și respectiv 2,52 × 107 celule ml -1, respectiv (Tabelul 4), confirmând cantitățile similare de metanogeni raportate anterior 22, 26). Proporțiile și numerele de copii absolute ale genelor ARNr 16S ale lui M. stadtmanae și Methanobrevibacter sp. tulpina AbM4 au fost semnificativ mai mici (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Comparația numărului de copii ale genelor metanogen 16S rRNA la animalele L-RFI și H-RFI a

Analiza statistică a covariației a fost efectuată pentru populația speciilor vizate, populația totală de metanogen și RFI. Methanobrevibacter sp. populațiile tulpina AbM4 și M. stadtmanae au fost corelate pozitiv cu cantitatea totală de metanogen (P = 0,033 și, respectiv, 0,011). Metanogenul total, Methanobrevibacter sp. populația tulpinii AbM4 și M. stadtmanae nu au fost corelate liniar cu clasamentul RFI (P a variat între 0,17 și 0,69).

DISCUŢIE