Abstract

Introducere

Disfuncția endotelială joacă un rol crucial în dezvoltarea aterosclerozei și a evenimentelor cardiovasculare (1-3). Este prezent în diabetul de tip 2 (4,5) și este asociat cu concentrațiile postprandiale de glucoză din sânge și trigliceride (6-8). Atât hiperglicemia postprandială, cât și hipertrigliceridemia sunt ameliorate de agoniștii receptorilor GLP-1 (GLP-1R) (9-13), indicând potențialul acestor medicamente pentru diabet pentru a îmbunătăți funcția endotelială (EF).

disfuncției

În studiul nostru anterior, o singură injecție de exenatidă agonistă GLP-1R a inhibat creșterea post-masă a concentrațiilor de glucoză și trigliceride și a îmbunătățit EF după o singură masă bogată în grăsimi la subiecții cu toleranță la glucoză (IGT) afectată și cu diagnostic recent, controlat de dietă 2 diabet (14). Deși îmbunătățirea EF a fost similară la pacienții cu IGT și diabet, modelul modificării EF a apărut diferit și, în timp ce pacienții IGT au demonstrat o creștere absolută a vasodilatației postprandiale cu exenatidă, pacienții cu diabet au arătat o ameliorare a scăderii induse de masă a EF . Nu se cunoaște dacă exenatida poate îmbunătăți EF la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 pe parcursul meselor de zi ulterioare și dacă aceste beneficii vasculare ar fi prezente la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 cu durată mai lungă și poate cu disfuncție vasculară mai mare, este în mare parte necunoscut.

Deși am constatat că o parte a efectului exenatidei asupra EF a fost explicată de o reducere a concentrațiilor plasmatice de trigliceride (14), unele dintre îmbunătățirile induse de exenatidă ale EF au fost independente de reducerile glucozei și trigliceridelor plasmatice, susținând conceptul de vasorelaxare dependentă de endoteliu de către agoniști GLP-1R (15-24). Acțiunea vasculară directă a agonistului GLP-1R poate implica mai multe mecanisme. În timp ce studiile anterioare la rozătoare au implicat un rol al unei căi mediate non-GLP-1R activată în principal de produsele de degradare GLP-1 (19,20), date mai recente in vitro și in vivo indică o acțiune directă prin intermediul GLP-1Rs 22,24 endotelial. ). În sprijinul acestuia din urmă, mai multe căi de kinază cunoscute pentru a activa oxidul azotic endotelial (NO) sintază (eNOS) și a crește producția de NO sunt in vitro reglate în sus de diferiți agoniști GLP-1R (25-28). Cu toate acestea, care dintre aceste căi specifice postreceptorului ar putea explica efectul exenatidei asupra EF la om rămâne în mare parte necunoscut.

Pentru a clarifica aceste întrebări, am studiat 1) dacă exenatida are efecte favorabile asupra EF pe parcursul meselor secvențiale în diabetul de tip 2, 2) dacă aceste efecte apar și la pacienții cu diabet de tip 2 mai stabilit și 3) în ce măsură efectele exenatidei ar putea fi explicată prin acțiunea directă a exenatidei prin GLP-1Rs. În plus, am cercetat căi moleculare responsabile de acțiunea agonistă GLP-1R folosind arteriole umane și celule endoteliale.

Proiectare și metode de cercetare

Două studii randomizate, dublu-orb, încrucișate au fost aprobate de către comisia de revizuire instituțională. Toți subiecții au acordat consimțământul informat înainte de participare. Pacienții din ambele studii au primit doze stabile de tensiune arterială și medicamente pentru scăderea lipidelor timp de 3 luni înainte de înscriere.

Studiul 1

Studiul 2

Participanții cu IGT sau diagnosticați recent (am După măsurarea inițială a EF, cateterele au fost plasate în vena antecubitală (pentru perfuzie cu medicamente) și în vena mâinii dorsale (pentru prelevarea de sânge) a brațului dominant și, respectiv, nedominant. Șaizeci de minute după măsurarea inițială a EF, a fost inițiată o infuzie continuă (6000 pmol/L/kg) continuă (600 pmol/L/kg ⋅ min) de exendină-9 (Bachem, Bubendorf, Elveția) sau un volum echivalent de ser fiziologic. După 30 de minute, o perfuzie intravenoasă de s-a introdus exenatidă (50 ng/min) sau un volum echivalent de placebo. S-a demonstrat că această rată de perfuzie de exenatidă oferă o concentrație rapidă și stabilă similară cu concentrațiile maxime după injecțiile tipice de exenatidă subcutanată (30). Soluțiile au fost preparate printr-o cercetare- farmacist dedicat pentru a se asigura că personalul din studiu a rămas orb. Măsurarea EF a fost repetată 30 de minute în perfuzie cu exenatidă/placebo. Utilizarea intravenoasă a exendin-9 și exenatidă a fost aprobată în SUA . Food and Drug Administration IND 108.117 (J.K.). Probele de sânge pentru măsurarea glucozei și insulinei au fost luate înainte de fiecare etapă de perfuzie și cu 10 minute înainte de a doua măsurare EF, după care linia de prelevare a sângelui a fost retrasă pentru a evita posibile interferențe cu măsurarea EF.

Măsurarea EF

EF a fost evaluat prin tonometrie arterială periferică (PAT) (ENDO-PAT2000; Itamar Medical, Caesarea, Israel) așa cum s-a detaliat anterior (14). Răspunsurile pulsatile continue ale volumului de sânge de la ambele degete arătătoare au fost înregistrate pe parcursul unei perioade de echilibrare de 5 minute, o perioadă de 5 minute, incluzând umflarea suprasistolică a manșetei tensiunii arteriale pe brațul nedominant și o perioadă de 5 min de postinflație. Valorile indicelui reactiv de hiperemie (RHI) au fost normalizate la citirile din brațul contralateral. Coeficientul mediu de variație intrasubiect al măsurării RHI în laboratorul nostru este de 3% în aceeași zi secvențial și de 10% în două zile separate.

Studii în celulele endoteliale

Celulele endoteliale aortice umane (HAEC) și celulele endoteliale ale venei ombilicale umane (HUVEC) (Lonza; CC-2535 și respectiv CC-2517, Walkersville, MD) au fost menținute în mediu bazal endotelial (CC-3162; Lonza) suplimentat cu creșterea furnizată factori la 37 ° C într-un incubator umidificat suplimentat cu 5% CO2.

Pasajul 6-8 HAEC la confluența de 90-95% au fost tratați cu exendin-4 (adică exenatidă) cu sau fără pretratare cu compus inhibitor AMPK-C (CC) sau exendin-9 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), spălat cu PBS și lizat cu fosfatază adecvată și inhibitori de protează. AMPKα totală și fosforilată (situl de fosforilare Thr172), protein kinaza dependentă de AMPc (PKA, Thr197), Akt-kinaza (Ser473) și eNOS (Ser1177) au fost măsurate prin Western blots, folosind anticorpi de la Cell Signaling Technology (Beverly, MA) și normalizat la α-tubulină.

ARN-ul cu interferență specifică AMPKα1 (siRNAs) (TriFECTa Kit; IDT Inc., Coralville, IA) sau siRNA de control (IDT Inc.) au fost utilizate pentru a examina dacă AMPK a mediat efectele producției de NO. HUVEC-urile au fost utilizate pentru ușurarea transfecției utilizând reactivul de transfecție HiPerFect (Qiagen, Valencia, CA). Trecerea 3-5 celule la confluența 75-80% au fost transfectate timp de 24 de ore cu siRNA anti-AMPKα1 sau siRNA de control înainte de tratamentul cu 10 nmol/L exendin-4.

NO a fost măsurat utilizând diacetat de 4,5-diaminofluoresceină (DAF-2DA; Calbiochem, EMD Millipore, Billerica, MA). HAEC și HUVEC care au atins o confluență de 80% pe plăci cu 24 de godeuri au fost incubate cu 5 µmol/L DAF-2DA timp de 15 minute înainte de finalizarea tratamentului respectiv, spălate cu PBS (pH 7) și fixate în 4 % paraformaldehidă. Plăcile au fost fotografiate pe EVOS (Life Technologies, Grand Island, NY), iar intensitatea fluorescenței NO a fost analizată folosind ImageJ.

Studii de vasoreactivitate

Analize de laborator

Concentrațiile de glucoză plasmatică au fost măsurate la pat folosind un analizor de glucoză YSI 2700D (Yellow Springs, OH). Probele pentru alte măsurători în plasmă sau ser au fost depozitate la -80 ° C până la testarea lipidelor plasmatice (Abbott, Lake Forest, IL), insulinei plasmatice (EMD Millipore), apolipoproteinei B48 (apoB48; Biovendor, Asheville, NC) și acetaminofenului Immunalysis, Pomona, CA) și concentrațiile de d-xiloză (34).

Analize statistice

Fluxul de participanți la studiile 1 (A) și 2 (B).

Caracteristicile clinice de bază ale participanților la finalizarea studiilor 1 și 2

Studiul 1

Treizeci și șase de subiecți au finalizat ambele brațe de tratament, unul s-a retras în timp ce se afla pe placebo, iar cinci s-au retras în timp ce se aflau pe exenatidă (Fig. 1A). Doi pacienți au avut greață cu 10 µg de exenatidă și au finalizat studiul pe 5 µg de exenatidă. Caracteristicile clinice nu au diferit între subgrupurile cu durata diabetului (Tabelul 1). Tratamentul cu exenatid a fost urmat de reduceri modeste ale greutății corporale, tensiunii arteriale sistolice, glucozei în repaus alimentar și concentrațiilor totale de colesterol HDL (Tabelul 2). Toți participanții au consumat întreaga masă de testare. Răspunsurile la glucoză și insulină după micul dejun au fost mai mici, iar răspunsurile la insulină după prânz au fost mai mari după exenatidă (Fig. 2A și B). Excursiile postprandiale de trigliceride și apoB48 au fost reduse semnificativ după exenatidă (Fig. 2C și D). Concentrațiile de acetaminofen au arătat o interacțiune semnificativă între tratament și timp, în tendințe mai mici de 2 ore după micul dejun după exenatidă (P = 0,01), în timp ce concentrațiile post-prânz de d-xiloză nu au fost diferite între tratamente (Fig. Suplimentară 1).

Caracteristici clinice și concentrații în sânge la jeun a mai multor variabile metabolice după 10 zile de tratament cu exenatidă și placebo la 36 de pacienți care au finalizat studiul crossover 1

Efectul exenatidei asupra concentrațiilor plasmatice de glucoză (A), insulină (B), trigliceride (C) și apoB48 (D) în studiul 1. În ziua 11 de tratament, imediat după prelevarea inițială a sângelui (timpul 0), medicamentul de studiu a fost injectat și participanții au ingerat o masă de mic dejun (BF) și 4 ore mai târziu o masă de prânz (L). Datele sunt mijloace ± SE. † P 0,5 ambele).

Discuţie

În studiul nostru anterior, o singură doză de exenatidă a avut efecte favorabile atât asupra nivelurilor de lipide postprandiale cât și asupra EF la participanții cu IGT sau diabet cu debut nou. Cu toate acestea, mai multe întrebări cheie au rămas fără răspuns. De exemplu, nu a fost clar dacă beneficiile neglicemice ale exenatidei s-ar extinde dincolo de o singură doză acută. Acest lucru a fost clar răspuns afirmativ în studiul actual, deoarece modificări robuste similare ale concentrațiilor de trigliceride și EF au avut loc în urma utilizării mai cronice a exenatidei în studiul 1. Deși o scădere modestă în greutate a avut loc cu utilizarea mai lungă a exenatidei, această mică modificare nu a avut loc. pentru îmbunătățirea substanțială a rezultatelor metabolice și vasculare.

Agoniștii GLP-1R pot reduce absorbția nutrienților intestinali prin încetinirea golirii gastrice (12: 36-38). Astfel, a fost posibil ca prin simpla întârziere a absorbției nutrienților, exenatida să reducă creșterea postprandială a concentrațiilor de lipide și glucoză plasmatică și să amâne vârful acestora până după mesele ulterioare. Prin urmare, am evaluat golirea gastrică prin măsurarea acetaminofenului absorbit și a d-xilozei la micul dejun și, respectiv, la mesele de prânz. În concordanță cu studiile anterioare care arată golirea gastrică mai lentă cu agoniști GLP-1R (37,39), concentrațiile de acetaminofen post-mic dejun au fost reduse după injecția cu exenatidă. Cu toate acestea, această reducere a fost modestă și a fost observată doar la momentul de 2 ore. Întârzierea timpurie corespunzătoare a vârfului de glucoză postprandial este în acord cu implicarea golirii gastrice în efectele exenatidei de scădere a glucozei (37,39). În schimb, creșterea discordantă a meselor între apoB48 sau trigliceride plasmatice și acetaminofen sau d-xiloză indică mecanisme suplimentare de scădere a trigliceridelor prin exenatidă, cum ar fi inhibarea producției de lipoproteine ​​intestinale și eliberarea trigliceridelor, așa cum se arată anterior (40).

În studiul nostru anterior, EF a fost testat numai la persoanele cu IGT sau diabet cu durată foarte scurtă (2) și/sau niveluri mai mari de exenatide sistemice rezultate din mai multă terapie cronică (11 zile vs. doză unică) în studiul actual.

Mai mult de o treime din efectul exenatidei asupra EF în studiul nostru anterior a rămas neexplicat de modificările nutrienților din plasmă (14). Deși a fost posibil ca porțiunea inexplicabilă să reflecte pur și simplu o potrivire imprecisă a punctelor de timp ale măsurării EF și extragerea sângelui pentru concentrațiile plasmatice de glucoză și lipide, am bănuit că ar putea exista un efect direct al exenatidei asupra EF. Chiar și cu măsurile EF și plasmă legate temporar în studiul actual, îmbunătățirea EF după exenatidă a fost legată doar parțial de modificările concentrațiilor trigliceridelor plasmatice și ale glucozei, sugerând o acțiune vasculară suplimentară a exenatidei. Pentru a testa acest punct, exenatida a fost perfuzată în condiții de repaus alimentar în studiul 2 la o rată cunoscută pentru a obține concentrații de exenatide comparabile cu cele obținute cu dozarea standard a injecției de exenatidă subcutanată (30). EF a fost crescut cu aproape 20% în timpul perfuziei cu exenatidă, comparativ cu placebo. Acest lucru este în acord cu un raport anterior care arată EF îmbunătățit după injecția subcutanată de exenatidă (24) și studii anterioare care demonstrează creșteri ale EF după perfuzia intravenoasă de GLP-1 (17,18).

De asemenea, am emis ipoteza că agoniștii GLP-1R îmbunătățesc EF direct prin GLP-1R endoteliale (19). Studiile anterioare in vitro au arătat inhibitorul GLP-1R exendin-9 activat antagonizat indus de exenatidă al eNOS în celule endoteliale cultivate (26). În concordanță cu aceasta, activarea eNOS indusă de exenatidă și producția de NO în HAECs. Mai mult, exendin-9 a abolit complet efectul perfuziei de exenatidă asupra EF, oferind dovezi importante in vivo pentru implicarea GLP-1R în efectul vasodilatației agoniștilor GLP-1R.

S-a demonstrat anterior că agoniștii GLP-1R îmbunătățesc răspunsurile de vasodilatație ale vaselor de rozătoare ex vivo (15,16,22). În studiul nostru, arteriolele umane s-au dilatat într-o manieră dependentă de concentrație cu doze crescânde de exenatidă sau GLP-1. Foarte important, exenatida a fost deja eficientă la concentrații similare cu cele obținute cu dozarea terapeutică (42). Vasodilatația a fost inhibată de inhibitorul eNOS l -NAME, indicând un mecanism de acțiune exenatidic dependent de NO. Exenatida a restabilit, de asemenea, vasodilatația mediată de endoteliu care a fost atenuată de glucoză ridicată sau de produse de lipoliză VLDL. Protecția Exenatidei împotriva insuficienței ridicate a EF indusă de glucoză coincide cu un efect raportat anterior al GLP-1 în timpul hiperglicemiei in vivo (21). Acum demonstrăm descoperirea nouă că exenatida previne direct disfuncția endotelială indusă de lipide.

Dintre mai multe căi de kinază din aval GLP-1R postulate anterior ca relevante pentru activarea eNOS (25-27), numai AMPK a fost activat de exenatidă în HAEC. Activarea AMPK pare să preceadă fosforilarea eNOS, în concordanță cu rapoartele acestei secvențe de cale (43,44). Susținând un rol cheie al AMPK în vasodilatația endotelială de către agoniștii GLP-1R, AICAR a reprodus efectul și CC a inhibat vasodilatația indusă de exenatide și GLP-1 în arteriolele umane. Mai mult, CC a fost aproape la fel de eficient ca l -NAME în blocarea vasodilatației exenatidelor și, de asemenea, a abolit protecția exenatidei împotriva afectării induse de glucoză sau lipidă a vasodilatației mediată endoteliul ex vivo. În HAEC, CC a blocat, de asemenea, activarea eNOS indusă de exenatidă și producția de NO. Pentru a exclude posibilitatea ca CC să fi modulat acțiunea exenatidei prin inhibarea altor căi de kinază (45), am dărâmat transcrierea AMPKα în HUVECs și am constatat reduceri ale producției de NO indusă de exenatidă în celule lipsite de AMPKα.

Există mai multe limitări potențiale ale studiului. Majoritatea participanților au fost bărbați și nu putem extinde cu încredere rezultatele noastre in vivo la femei. Deși dovezile anterioare (46) sugerează că este puțin probabil ca exendin-9 să aibă consecințe vasculare dincolo de interferența sa cu acțiunea exenatidă, acest lucru nu poate fi exclus în totalitate. PAT a fost ales pentru acest studiu datorită reproductibilității sale excelente în timpul măsurătorilor repetate, corelației bune cu metodele standard de aur stabilite (dilatarea mediată de fluxul brahial, măsurarea directă a EF a arterei coronare și pletismografia antebrațului) și asocierea dovedită cu riscul cardiovascular la populațiile mari (47-49).

În concluzie, studiile noastre in vivo și ex vivo au arătat că 1) exenatida agonistă GLP-1R a îmbunătățit EF peste două mese secvențiale la persoanele cu diabet de tip 2 de durată scurtă până la moderată, 2) exenatida a îmbunătățit EF printr-un GLP-1R vascular direct. –Mecanism mediatizat, 3) exenatidă prin acțiune vasculară directă ameliorat atât disfuncția endotelială indusă de glucoză ridicată, cât și lipidă și 4) exenatidă a stimulat activitatea căii AMPK endoteliale, rezultând o mai mare activare eNOS și producție de NO. Deoarece disfuncția endotelială este asociată cu progresia aterosclerozei (50) și prezice evenimente cardiovasculare clinice (1-3), descoperirile noastre oferă un sprijin conceptual și mecanic suplimentar pentru utilizarea potențială a agoniștilor GLP-1R în protecția cardiovasculară în diabetul de tip 2.

Informații despre articol

Mulțumiri. Autorii recunosc asistența excelentă a proiectului oferită de Linda McDonald RN, Irina Moroz, Keith Rasmussen, Ashley Haile și Dewayne C. Thurmond (toate la Phoenix VA Health Care System).

Finanțarea. Această lucrare a fost susținută parțial de Asociația Americană a Diabetului (1-10-CT-31 la JK), Fundația Amiloidoză (la RQM), Institutele Naționale de Sănătate (R21-HL-092344-01 la RQM), VA Merit (BLRD I01BX007080 la RQM) și Biroul de cercetare și dezvoltare, Departamentul Afacerilor Veteranilor (1I01CX000598 la PDR). Amylin Lilly a furnizat medicamente de studiu fără costuri.

Conținutul acestui articol nu reprezintă punctele de vedere ale Departamentului Afacerilor Veteranilor sau ale S.U.A. Guvern.

Dualitatea interesului. P.D.R. a primit granturi de cercetare de la Bristol-Myers Squibb. Nu au fost raportate alte potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.

Contribuțiile autorului. J.K. a proiectat studiul, a obținut finanțare, a generat date de cercetare și a pregătit manuscrisul. DOMNIȘOARĂ. și C.B. a cercetat datele și a revizuit și editat manuscrisul. K.M.D. a proiectat experimentele, a generat date de cercetare și a editat manuscrisul. K.R. a colectat datele și a editat manuscrisul. J.L. a generat date de cercetare și a editat manuscrisul. SF. și D.A.F. a proiectat experimentele și a editat manuscrisul. E.A.S. a ajutat la proiectarea experimentelor, a colectat datele și a editat manuscrisul. D.C.S. a ajutat la proiectarea studiului și a editat manuscrisul. D.D. consultat cu privire la proiectarea studiului și revizuit manuscrisul. R.Q.M. a ajutat la proiectarea experimentelor, a obținut finanțare și a revizuit și editat manuscrisul. P.D.R. a ajutat la proiectarea studiului și a experimentelor, a obținut finanțare și a revizuit și editat manuscrisul. J.K. este garantul acestei lucrări și, ca atare, a avut acces deplin la toate datele din studiu și își asumă responsabilitatea pentru integritatea datelor și acuratețea analizei datelor.

Prezentare prealabilă. Părți ale acestui studiu au fost prezentate la cele 73 de sesiuni științifice ale Asociației Americane de Diabet, Chicago, IL, 21-25 iunie 2013 și la cele 74 de sesiuni științifice ale Asociației Americane de Diabet, San Francisco, CA, 13-17 iunie 2014.