Amol L. Shirfule

1 Centrul de cercetare în domeniul toxicologiei alimentelor și medicamentelor, Institutul Național de Nutriție, Hyderabad 500007, India

antiurolitice

Venkatesh Racharla

2 Departamentul de farmacologie, Colegiul de farmacie CMR, Hyderabad 500007, India

S. S. Y. H. Qadri

3 Divizia Patologie, Institutul Național de Nutriție, Hyderabad 500007, India

Arjun L. Khandare

1 Centrul de cercetare în domeniul toxicologiei alimentelor și medicamentelor, Institutul Național de Nutriție, Hyderabad 500007, India

Abstract

1. Introducere

Urolitiaza oxalatului de calciu a devenit o problemă în creștere în multe țări din cauza variațiilor geografice/genetice și a stilurilor de viață moderne. Persoanele care trăiesc în secetă și zona aridă suferă mai mult de hiperabsorbția intestinală a oxalatului de calciu care duce la pietre la rinichi. Se estimează că 12% din populația lumii este afectată de pietre la rinichi, cu o rată de recurență de la 70 la 80% la bărbați și de la 47 la 60% la femei [1, 2]. Pietrele care conțin calciu sunt cele mai frecvente, cuprinzând aproximativ 75% din toate calculele urinare, care sunt observate sub formă de oxalat de calciu pur (50%) sau fosfat de calciu (5%) și un amestec al acestora (45%). Mulți factori afectează creșterea calculilor urinari, în care metabolismul mineralului joacă un rol important [3].

Deși, GPF este bine recunoscut în medicina tradițională indiană ca având efect antiurolitic, dar nu au fost publicate date științifice care să susțină mecanismul său de acțiune subiacent asupra calculilor cu oxalat de calciu. Prin urmare, acest studiu a fost propus pentru a determina potențialul terapeutic și mecanismul de acțiune al extractelor apoase din această formulare în gestionarea urolitiazei prin utilizarea metodelor in vitro și in vivo.

2. Material și metode

2.1. Produse chimice și reactivi

Toate substanțele chimice utilizate au fost de calitate analitică. Etilenglicol, timol, glutation redus, 5-5'-ditiobis, acid 2-nitrobenzoic, acid tiobarbituric, furosemid, H2O2, acid tricloracetic, 1,1,3,3, -tetraetoxipropan și clorhidrat de guanidină au fost obținute de la Sigma Chemical Company, Sf. Louis, MO, SUA. Reactivii utilizați pentru preparatele histologice au fost solubili în eozină, hematoxilină și xilen de la Himedia Chemical Limited, Bombay, India. Kituri utilizate în acest studiu pentru determinarea calciu, magneziu, azot uree din sânge (BUN), creatinină, superoxid dismutază, glutation peroxidază, oxalat și citrat au fost achiziționate de la Spinreact, Germania și Ambika diagnostic, India.

2.2. Materiale vegetale

Plantele utilizate pentru formulare au fost colectate din pădurile locale din districtul Nanded, Maharashtra, India și autentificate de experți. Exemplarele de voucher au fost depuse în ierbarul Școlii de Științe ale Vieții, S.R.T.M. Universitatea, Maharashtra, India. Părțile respective ale fiecărei plante menționate anterior au fost colectate și apoi uscate la umbră. Părțile uscate au fost curățate de materii străine și apoi împământate cu pulbere fină într-o râșniță.

2.3. Medicament standard

Formularea poliesterică Cystone de la Himalaya Drug Co., Bangalore, India a fost utilizată ca medicament standard în acest studiu. Formularea conținea Didymocarpus pedicellata, Saxifraga ligulata, Rubia cordifolia, Cyperus scariosus, Achyranthes aspera, Onosma bracteatum, Vernonia cinerea, Shilajeet purificat și Hajrul Yahood Bhasma.

2.4. Efect antioxidant in vitro

Efectul antioxidant al GPAE a fost determinat de activitatea de eliminare a radicalilor liberi și de efectele inhibitoare ale peroxidării lipidelor. S-a preparat o soluție 0,1 mM de radical DPPH în metanol și s-au adăugat 1 mL din această soluție la 3 mL de GPAE la concentrații diferite pentru a determina activitatea de eliminare a radicalilor liberi [22]. Soluțiile au fost incubate timp de 30 de minute la temperatura camerei, iar apoi absorbanța a fost măsurată la 517 nm. Scăderea absorbției soluției de DPPH a fost considerată ca o creștere a activității de eliminare a radicalilor DPPH. Această activitate este dată ca% DPPH eliminare radicală care a fost calculată în ecuație folosind soluția DPPH ca control.

Activitatea inhibitoare a peroxidării lipidelor a fost determinată în rinichii de șobolan izolați, care au fost omogenizați electric în soluție salină tampon fosfat 50 mM rece (PBS) și ajustată la pH 7,4. Omogenatul a fost procesat în continuare, iar activitatea inhibitoare a peroxidării lipidelor a fost determinată printr-o metodă raportată [23]. Raportul de inhibare a fost calculat utilizând formula dată pentru activitatea de eliminare a radicalilor liberi.

2.5. În Studiile Vivo

2.5.1. Animale

Îngrijirea și manipularea animalelor au fost în conformitate cu liniile directoare standard acceptate la nivel internațional pentru utilizarea animalelor, iar protocolul a fost aprobat de comitetul instituțional de etică a animalelor (numărul IAEC P25/7-2011/GBR) de la Institutul Național de Nutriție, Hyderabad, India. Șobolanii Wistar (180-220 g) de oricare dintre sexele utilizate pentru acest studiu au fost furnizați și adăpostiți la Centrul Național pentru Științe Animale de Laborator, Hyderabad, India și păstrați în cuști de plastic (47 cm × 34 cm × 18 cm) cu praf de fierăstrău (reînnoit după fiecare 48 h), la o temperatură controlată de 23-25 ​​° C și 12 h ciclu lumină-întuneric. Animalelor li s-a administrat o dietă standard de șobolan, disponibilă în centru. Animalele au avut acces gratuit la alimente și apă ad libitum pe tot parcursul studiului, cu excepția a 24 de ore înainte și în timpul a 6 ore de studiu diuretic, iar în timp ce colectau probe de urină de 24 de ore, alimentele au fost retrase.

2.5.2. Pregătirea GPAE și Cystone pentru hrana gastrică

Inițial, GPF a fost preparat amestecând în mod egal părțile respective ale fiecărei plante la un raport de 1: 1: 1: 1: 1, respectiv. Pentru a pregăti decoctul pentru gavaje gastrice, 100 g de GPF și 500 ml de apă dublu distilată (dd) au fost încălzite într-o autoclavă timp de 15 minute la 121 ° C. După procedeul de fierbere și sterilizare, pulberea s-a transformat într-o pastă asemănătoare jeleului care a fost dizolvată în apă dd pentru a ajunge la un volum final de 750 ml. Apoi, soluția a fost păstrată la 4 ° C timp de 7 zile. Ulterior, soluția a fost turnată și centrifugată la o rată de 1.500 rpm timp de 10 min. În cele din urmă, a fost preparată soluția de alimentare GPAE conținând 50 mg de formulare pe mililitru. Aceeași procedură a fost efectuată pentru ca Cystone să producă 100 mg pe mililitru de soluție.

2.5.3. Activitatea diuretică a GPAE

Activitatea diuretică a GPAE a fost studiată pe șobolani Wistar de ambele sexe (180-220 g) așa cum s-a descris anterior [24]. Animalele au fost împărțite cu greutatea corporală și sexul asortate în grupuri de câte 6 animale. Grupurilor de control de droguri negative și standard li s-au administrat soluție salină prin gavaj (20 ml/kg) și, respectiv, Furosemid (10 mg/kg greutate corporală). Restul grupurilor li s-au administrat doze diferite de GPAE (25, 50 și 100 mg/kg) dizolvate în soluție salină. Ulterior, animalele au fost plasate individual în cuști metabolice și diuretice. Urina a fost colectată, în butelii gradate timp de 6 ore la intervale de 1 oră. S-a colectat urina totală excretată și s-a determinat volumul. PH-ul urinei colectate de la fiecare animal a fost determinat folosind pH-metru, concentrațiile de Na + și K + pe fotometrul de flacără și concentrația de Ca 2+ utilizând truse disponibile în comerț.

2.5.4. Efectul GPAE și Cystone asupra modelului animal al urolitiazei

Activitatea antiurolitică a GPAE și Cystone a fost determinată într-un model animal de urolitiază de oxalat de calciu, așa cum este descris de Atmani și colab. [25]. Doza care a provocat creșterea semnificativă a debitului de urină în studiul diureză a fost selectată pentru acest studiu. Douăzeci și patru de șobolani masculi Wistar (cu o greutate de 180-220 g) au fost împărțiți cu greutăți corporale potrivite în 5 grupe de câte 6 animale, care au fost apoi selectate aleator pentru a primi diferite tratamente după cum urmează.

Șobolanii din grupa I, serviți ca martor tratați cu vehiculul, au primit injecții intraperitoneale (i.p.) cu soluție salină normală (2,5 ml) o dată în 24 de ore și apă ad libitum zilnic timp de 21 de zile (control normal).

Șobolanii din grupa II au primit tratament care induce piatră timp de 21 de zile, compus din 0,75% (g/v) EG cu 1% (g/v) clorură de amoniu timp de 5 zile; după aceasta, alimentarea cu apă a fost comutată la 0,75% EG singură în apă, împreună cu tratamentul cu soluție salină (grupul urolitic cu control pozitiv).

Șobolanii din grupa III au primit GPAE (50 mg/kg) prin gavaje gastrice și au primit simultan tratament inductiv de piatră similar cu controlul pozitiv zilnic timp de 21 de zile (grup de tratament, doză mică).

Șobolanii din grupa IV au primit GPAE (100 mg/kg) prin gavaje gastrice și au primit simultan tratament inductor de piatră similar cu controlul pozitiv zilnic timp de 21 de zile (grup de tratament, doză mare).

Șobolanii din grupa V au primit medicament standard Cystone, (100 mg/kg) prin gavaje gastrice și au primit simultan tratament inductor de piatră similar cu controlul pozitiv zilnic timp de 21 de zile (grup de tratament, medicament standard).

2.5.5. Examinare biochimică

Imediat înainte și la sfârșitul unui total de 21 de zile de tratament, au fost recoltate probe de urină de 24 de ore în prezența a câteva cristale de timol, prin adăpostirea individuală a animalelor în cuștile metabolice și diuretice. Aportul de apă a fost, de asemenea, determinat simultan. După determinarea volumului și pH-ului, o parte din fiecare probă de urină de 24 ore a fost acidulată la pH 2 cu HCI 5 M. Ambele probe de urină acidifiate și neacidificate au fost apoi centrifugate la 1500 × g timp de 10 min pentru a îndepărta resturile și supernatanții au fost depozitați la -20 ° C până la analizare. În probele de urină acidificată, conținutul de oxalat, calciu (Ca 2+) și magneziu (Mg 2+) a fost determinat utilizând truse disponibile în comerț, în timp ce excreția de fosfat anorganic a fost determinată printr-o metodă raportată [26]. În probele de urină neacidificată, citratul, creatinina și acidul uric, în timp ce în ser, creatinina și BUN au fost estimate cu ajutorul metodelor bazate pe kit.

Sângele a fost colectat prin puncție cardiacă de la animale sub anestezie eterică și, în consecință, atât rinichii, cât și ficatul au fost excizați. Animalele au fost apoi sacrificate prin inhalarea CO2.

2.5.6. Examen histopatologic

Organele au fost clătite în ser fiziologic răcit cu gheață și cântărite. Rinichiul drept a fost fixat în formalină tamponată neutră 10%, procesat în serie de alcool gradat și xilen, încorporat în ceară de parafină, secționat la 5 μm și colorat cu hematoxilină și eozină pentru examinare la microscopul cu lumină polarizată. Pentru a număra numărul de depozite cristaline, un câmp de 100x a fost apoi selectat aleatoriu din fiecare regiune și au fost numărate depozitele de oxalat de calciu. A fost raportat numărul total de depozite în fiecare specimen, iar conținutul de calciu din țesuturile renale a fost determinat prin spectrofotometru de absorbție atomică.

2.5.7. Efectul inhibitor al peroxidării lipidelor

Rinichiul stâng a fost prelucrat în omogenat 10% în PBS (50 mM, pH 7,4), centrifugat la 1500 × g, iar supernatanții au fost folosiți pentru a evalua diferite activități ale enzimelor formând antioxidanți și oxalat și parametri biochimici precum glutation redus (GSH), malondialdehidă (MDA) și conținutul de proteine ​​carbonil.

Omogenatele de rinichi au fost estimate pentru conținutul de MDA prin metoda reactivă a acidului tiobarbituric [27]. Conținutul de carbonil proteic a fost estimat prin derivatizarea proteinei cu dinitrofenil hidrazină (DNPH) în dinitrofenil hidrazone cromoforice prin metoda Levine și colab. [28], iar conținutul de carbonil a fost calculat utilizând coeficientul de stingere molară DNPH de 22.000 M -1 cm -1. GSH a fost estimat ca un grup total de tiol neproteic (SH) urmând metoda descrisă de Moron și colab. [29]. Superoxid dismutaza (SOD) și glutation peroxidaza (GPx) au fost determinate folosind kituri disponibile comercial. Activitatea catalazei a fost determinată prin monitorizarea descompunerii H2O2 la 240 nm cu un spectrofotometru [30]. Activitatea catalazei a fost calculată utilizând ε 240 (coeficient de extincție molar) = 0,0394 mmol -1 min -1 pentru H2O2 și exprimată ca μmoli de H2O2 descompuse pe minut în condiții standard la 25 ° C. Activitatea glicolat oxidazei (GOx) în ficat și lactatul dehidrogenază (LDH) atât în ​​ficat, cât și în rinichi au fost determinate printr-o metodă raportată [31, 32].

2.5.8. Analize statistice

Datele exprimate sunt media ± eroarea standard a mediei (S.E.M.) și concentrația inhibitoare mediană (valoarea IC50) cu intervale de încredere de 95%. Toate comparațiile statistice între grupuri sunt realizate prin intermediul unei analize unice a varianței cu testul t Student post hoc. Valorile P mai mici de 0,05 sunt considerate semnificative. Curbele concentrație-răspuns au fost analizate prin regresie neliniară folosind Graph Pad Prism (Graph Pad Software, San Diego, CA, SUA).

3. Rezultatul

3.1. Studii in vitro

3.1.1. Efect antioxidant

GPAE a dezvăluit o activitate de eliminare a radicalilor DPPH cu o valoare IC50 de 2,5 (1,05-2,90) μg/ml (Figura 1 (a)) și a inhibat peroxidarea lipidică a omogenatului de rinichi de șobolan in vitro cu 36,37 ± 1,86 și 68,72 ± 0,25% la 50 și 150 μg/ml, respectiv (Figura 1 (b)). Produsul chimic standard, BHT, a arătat în mod similar activitate de eliminare a radicalilor DPPH cu valoare IC50 de 2,56 (1,02-2,85) μg/ml și a inhibat peroxidarea lipidelor in vitro cu 38,4 ± 1,22 și 94,5 ± 4,6% la 50 și 150 μg/ml, respectiv.