CHANG HWA JUNG

1 Divizia de Cercetare a Metabolismului și Funcționalității, Institutul de Cercetări Alimentare din Coreea, Seongnam 463-746;

JIYUN AHN

1 Divizia de Cercetare a Metabolismului și Funcționalității, Institutul de Cercetări Alimentare din Coreea, Seongnam 463-746;

TAE-IL JEON

1 Divizia de Cercetare a Metabolismului și Funcționalității, Institutul de Cercetări Alimentare din Coreea, Seongnam 463-746;

TAE WAN KIM

2 Departamentul de Știința Alimentelor și Biotehnologie, Universitatea Națională Andong, Gyeongbuk 760-749, Republica Coreea

TAE YOUL HA

1 Divizia de Cercetare a Metabolismului și Funcționalității, Institutul de Cercetări Alimentare din Coreea, Seongnam 463-746;

Abstract

Introducere

Excesul de greutate și obezitatea au devenit probleme globale grave în ultimii ani, cu un raport recent care estimează că 1,5 miliarde de adulți din întreaga lume sunt supraponderali, dintre care peste 200 de milioane de bărbați și aproape 300 de milioane de femei sunt obezi (1). Excesul de greutate și obezitatea au fost cândva considerate probleme asociate națiunilor cu venituri ridicate, dar incidența lor crește acum în țările cu venituri mici și medii, o tendință care este atribuită alcoolismului cronic, excesului de consum alimentar și stilului de viață sedentar. Persoanele supraponderale și obeze se confruntă cu riscul numeroaselor boli cronice, inclusiv boli de inimă, diabet și unele tipuri de cancer, precum și probleme psihologice și sociale.

Excesul de greutate și obezitatea, precum și bolile netransmisibile asociate cu dezvoltarea lor, sunt în mare parte prevenibile. Mai mulți pași pot fi luați nu numai la nivel individual și social, ci și la nivel molecular pentru a preveni și trata supraponderalitatea și obezitatea. La nivel individual, indivizii sunt capabili să-și limiteze consumul de grăsimi și zahăr, să mărească consumul de fructe și legume și să se angajeze în activitate fizică regulată. La nivel social, guvernele și industria alimentară pot promova diete sănătoase. La nivel molecular, cercetătorii identifică și/sau dezvoltă agenți care previn sau tratează obezitatea. O cercetare recentă sa concentrat asupra dezvoltării agenților anti-obezitate derivați din produse naturale, un proces care are mai multe avantaje economice și de siguranță față de dezvoltarea produselor farmaceutice prin ani de investiții în dezvoltarea medicamentelor. O astfel de cercetare a fost susținută de rapoartele recente conform cărora extractele tradiționale din plante au fost găsite eficiente în reducerea greutății corporale in vivo (2,3).

Printre aceste extracte, mugurii de flori aromatici uscați ai Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry (familia Myrtaceae), cunoscută sub denumirea de cuișoare, a fost raportată a fi utilă în tratarea durerilor dentare, a cefaleei și a tulburărilor respiratorii în țările asiatice (4). Studiile fitochimice indică faptul că eugenolul, un membru al clasei fenilpropanoide a compușilor chimici și derivații săi, sunt responsabili pentru aroma unică a S. aromaticum și s-a constatat că are antimicrobiene, insecticide, antioxidante, antitumorale, antiinflamatoare și anestezice proprietăți (5-10). În ciuda acestor constatări și rapoarte ale utilității sale în mai multe aplicații medicinale, S. aromaticum nu a fost investigat pentru potențialul său ca agent anti-obezitate sau aditiv alimentar. Prin urmare, studiul de față a investigat efectul extractului de etanol S. aromaticum (SAE) asupra unui model de șoarece în care obezitatea fusese indusă prin administrarea unei diete bogate în grăsimi (HFD).

Materiale și metode

Materiale

Anti-PPARγ (sc-7273), SREBP-1 (sc-366) și CD36 (sc-13572) au fost achiziționate de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, SUA). Anticorpii împotriva FAS (# 3180) și β-actina (# 4967) au fost cumpărați de la Cell Signaling (Danvers, MA, SUA). Insulina (I5500), izobutilmetilxantina (I7018), dexametazona (D4902) și Oil Red O (O0625) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Kituri de trigliceride serice și tisulare (TG), colesterol total (TC) și kituri de lipoproteine-colesterol (HDL-C) de înaltă densitate au fost achiziționate de la Wako Chemicals (Osaka, Japonia). Un kit ELISA pentru insulină a fost obținut de la Shibayagi Co. (Gunma, Tokyo, Japonia). Un kit ELISA pentru leptină a fost achiziționat de la R&D Systems (Minneapolis, MN, SUA).

Pregătirea extractului

Mugurii de flori uscați de Syzygium aromaticum au fost cumpărați de la Omni Herb Company (Seul, Coreea de Sud) și au fost extrasați de trei ori cu 70% etanol la temperatura camerei peste noapte. Extractele au fost combinate și concentrate folosind un evaporator rotativ și liofilizate sub vid și dizolvate în dimetil sulfoxid (DMSO).

Cultura și diferențierea celulară

Celulele 3T3-L1 au fost cultivate în mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) cu 1% penicilină-streptomicină și 10% ser de vițel bovin la 37 ° C și 5% CO2. Celulele au fost însămânțate la o densitate de 4 × 105 celule/godeu într-o placă cu 6 godeuri. La 2 zile după confluență (ziua 0), celulele au fost expuse la o soluție MDI conținând 0,5 mM de 3-IBMX, 1 μM de dexametazonă și 1 μg/ml de insulină timp de 2 zile în DMEM cu 10% ser fetal bovin ( FBS). După inducție, celulele au fost trecute la o soluție care conține mediu DMEM suplimentat cu 1% penicilină-streptomicină, 10% FBS și 167 nm insulină timp de 2 zile. Celulele au fost menținute într-un mediu postdiferențiat (DMEM conținând 1% penicilină-streptomicină și 10% FBS) și modificate la fiecare 2 zile. Pentru a examina efectele SAE asupra diferențierii preadipocitelor în adipocite, celulele au fost tratate cu diferite concentrații de SAE la 2 zile după confluență (ziua 0).

Ulei de roșu O colorare

Pentru cuantificare, celulele au fost fixate cu 10% formalină neutră timp de 1 oră la temperatura camerei, spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și apoi colorate timp de 1 oră cu 0,5% ulei roșu O în izopropanol 60%. După spălare cu apă distilată, celulele colorate au fost observate la microscop. Picăturile lipidice colorate au fost apoi extrase cu izopropanol pentru cuantificare prin măsurarea absorbanței sale la 490 nm.

Modele animale

Șoareci masculi C57BL/6J cu vârsta de 4 săptămâni au fost obținuți de la Orient Bio Inc. (Seoul, Coreea de Sud) și aclimatizat la condițiile de laborator constând dintr-un ciclu de lumină-întuneric 12: 12-h, 24 ° C și 55% umiditate timp de 1 săptămână. La vârsta de 5 săptămâni șoarecii au fost apoi împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri; un grup a hrănit dieta Institutului American de Nutriție AIN-76A (grup normal), un grup a hrănit un HFD (grup HFD) și un grup a hrănit un HFD suplimentat cu 0,5% (g/g) SAE (grup HFD + SAE) timp de 9 săptămâni. Dietele experimentale au fost preparate prin completarea dietei de bază AIN-76 cu 20% grăsimi și 0,5% colesterol (g/g). Greutatea corporală și aportul mediu zilnic de alimente au fost măsurate săptămânal. Îngrijirea și utilizarea animalelor au urmat liniile directoare instituționale și naționale și toate procedurile experimentale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din Coreea Food Research Institute (KFRI-IACUC, # 2010-0011).

Pregătirea probelor și proceduri

La nouă săptămâni după consumarea dietelor experimentale, șoarecii au fost supuși postului timp de 12 ore și apoi sacrificați. Probele de sânge au fost colectate din aorta abdominală, centrifugate la 1000 × g timp de 15 minute și depozitate la -80 ° C. Măsurarea nivelurilor serice de TG, TC și HDL-C a fost efectuată cu setul adecvat. Măsurarea concentrațiilor serice de insulină și leptină a fost efectuată în conformitate cu instrucțiunile producătorului pentru seturile ELISA de insulină și leptină de șoarece. Țesuturile epididimale, perirenale și hepatice au fost excizate, cântărite și depozitate la -80 ° C până la utilizare. Plăcuțele de grăsime hepatică și epididimală au fost fie fixate în soluție de formalină 4% și prelucrate pentru examinare histologică, fie congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C până la extracția proteinelor și ARN-ului.

Pentru a determina nivelurile totale de lipide, TG și TC în ficat, ficatul fiecărei grupe a fost omogenizat în 5 ml NaCI. După ce s-au adăugat ulterior 20 ml soluție Folch (cloroform: metanol = 2: 1) la fiecare omogenat, soluția rezultată a fost incubată la 4 ° C timp de 12 ore. Probele au fost centrifugate timp de 10 minute la 1.000 × g înainte ca stratul organic să fie îndepărtat și uscat folosind un Speed ​​Vac. Peleta rezultată a fost dizolvată în alcool etilic conținând 25% Triton X-100 și apoi testată pentru nivelurile de TG, TC și HDL-C folosind truse comerciale indicate.

Analiza histologică

Plăcuțele hepatice și epididimale au fost fixate în 4% formalină tamponată neutră, încorporată în parafină, tăiată la o grosime de 5 μm și colorată cu colorare hematoxilină și eozină (H&E). Modificările patologice au fost evaluate și fotografiate la microscopul Olympus BX-51 (Olympus, Tokyo, Japonia).

Western blot

Ficatul izolat, țesutul adipos și extractele celulare au fost preparate în soluție de extracție a proteinelor PRO-PREP (Intron Biotechnology, Gyeonggi, Coreea de Sud) folosind un sistem MP 40 (MD Biosciences, St. Paul, MN, SUA). Extractele au fost centrifugate la 15.000 rpm timp de 20 minute la 4 ° C. Supernatanții au fost fierți cu un tampon de încărcare cu dodecil sulfat de sodiu (SDS), încărcat pe geluri Tris-glicină, transferați pe membrane de fluorură de polivinilidenă (PVDF) și vizualizați cu un reactiv de chemiluminescență (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, SUA).

Extracția ARN și PCR în timp real

ARN-ul total a fost izolat din ficat folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. După ce ADNc a fost preparat din ARN izolat folosind un premix Maxime RT (primer oligo dT), ADNc obținut a fost utilizat ca șablon pentru PCR în timp real cu sistemul Light Cycler 480 (Roche, Basel, Elveția). Primerii specifici au fost după cum urmează: Fas sense AGAGATCCCGAGACGCTTCT, antisens GCCTGGTAGGCATTCTGTAGT; Srebp sense GCAGCC ACCATCTAGCCTG, antisens CAGCAGTGAGTCTGCCTT GAT; Pparg sense TCGCTGATGCACTGCCTATG, antisens GAGAGGTCCACAGAGCTGATT; Ppara sense AACATC GAGTGTCGAATATGTGG, antisens AGCCGAATAGTT CGCCGAAAG; și sensul β-actinei AATACCCCAGCCATG TGTGT, antisens ATGGGCACTGTGTGTGACC. Nivelul ARNm a fost exprimat ca raportul intensității semnalului pentru fiecare genă în raport cu β-actina.

analize statistice

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SE, iar diferențele dintre cele trei grupuri au fost calculate utilizând o analiză a mai multor game și un test de varianță unidirecțional utilizând software-ul GraphPad Prism4 (San Diego, CA, SUA).

Rezultate

SAE inhibă diferențierea celulară a preadipocitelor 3T3-L1

Efectul tratamentului SAE asupra metabolismului lipidic in vitro a fost examinat prin investigarea efectului acestuia asupra diferențierii adipocitelor asupra celulelor 3T3-L1, o linie celulară bine stabilită de preadipocite folosită pentru a studia conversia preadipocitelor în adipocite. După diferențierea cu sau fără SAE, masa rezultată a lipidei intracelulare acumulate a fost colorată cu colorant Oil Red O și cuantificată. Așa cum se arată în FIG. 1, a fost observată o reducere dependentă de doză a acumulării lipidelor în celulele tratate cu SAE, sugerând că SAE inhibă factorii de transcripție a adipocitelor în timpul diferențierii adipocitelor.

etanol

Valorile sunt prezentate ca medie ± SD (n = 8).

SAE scade nivelurile serice de TG și TC la șoarecii hrăniți cu HFD

După 9 săptămâni de tratament, nivelurile TG și TC ale grupului HFD + SAE s-au dovedit a fi semnificativ mai mici, cu 33,4 și respectiv 8,8% mai mici decât cele din grupul HFD (Fig. 3A), sugerând că SAE exercită o hipolipidemie efect la șoareci hrăniți cu HFD.

SAE îmbunătățește trigliceridele serice, colesterolul total, colesterolul lipoproteic cu densitate ridicată, glucoza, insulina și leptina la șoarecii alimentați cu diete bogate în grăsimi. Toate nivelurile au fost analizate folosind kituri ELISA. Datele sunt exprimate ca medie ± SD. a, b Diferențe semnificative (P Fig. 3B) și grupul HFD + SAE, sugerând că nivelurile crescute datorate alimentării cu HFD au fost reduse semnificativ prin suplimentarea cu SAE. Aceste descoperiri indică faptul că nivelurile mai mici de glucoză și insulină serice se pot datora unei rezistențe mai mici la insulină.

SAE suprimă adipogeneza la șoarecii hrăniți cu HFD

Suplimentarea cu SAE s-a dovedit a reduce dimensiunea tamponului de grăsime epididimală la șoarecii hrăniți cu HFD (Fig. 4A). Investigația modului în care suplimentarea cu SAE reduce greutatea epididimală a grăsimii a arătat că suprimă expresia mai multor proteine ​​legate de genele adipogenezei, inclusiv SREBP-1, PPARγ și FAS (Fig. 4B), indicând faptul că exercită un anti-obezitate efect prin inhibarea adipogenezei.

SAE reduce dimensiunea tampoanelor de grăsime epididimale la șoarecii cu hrană bogată în grăsimi. (A) Tampoanele de grăsime epididimale au fost fixate, secționate și colorate cu hematoxilină și eozină. (B) Nivelurile de proteine ​​ale genelor adipogene din tampoanele de grăsime epididimale au fost măsurate prin analiza Western blot. Dieta N, AIN-76A; HFD, dietă bogată în grăsimi; HFD + SAE, dietă bogată în grăsimi + supliment de SAE; SAE, extract de etanol S. aromaticum.

SAE atenuează ficatul gras la șoarecii hrăniți cu HFD

Comparația efectului suplimentării cu SAE asupra gradului de acumulare a lipidelor în ficatul grupurilor HFD + SAE și HFD prin colorarea H&E a indicat o colorare albă redusă și mai puține picături de lipide și cercuri necolorate în ficatul grupului HFD + SAE comparativ cu Grupul HFD (Fig. 5A). Nivelurile totale de lipide, TC și TG din grupul HFD + SAE s-au dovedit a fi scăzut cu 45,2, 37,5 și respectiv 39,5% (Fig. 5B). Aceste rezultate sugerează că suplimentarea cu SAE a atenuat creșterea nivelurilor hepatice de TG și TC datorită hrănirii cu HFD.

SAE reglează nivelurile de proteine ​​și ARNm ale genelor lipogene din ficat la șoarecii alimentați cu diete bogate în grăsimi. (A) Ficatul a fost fixat, secționat și colorat cu hematoxilină și eozină. (B) Lipidele totale hepatice, trigliceridele și nivelurile totale de colesterol au fost analizate folosind truse ELISA. (C) Nivelurile de proteine ​​ale genelor lipogene din ficat au fost măsurate prin analiza Western blot. (D) Exprimarea factorilor de transcripție în ficat, măsurată prin RT-PCR. Datele sunt exprimate ca medie ± SD. a - c Diferențe semnificative (P Fig. 5C). Compararea acestor factori în grupurile HFD și HFD + SAE a indicat faptul că suplimentarea cu SAE și-a redus nivelurile în grupul HFD + SAE, oferind dovezi suplimentare ale efectelor anti-lipogene ale SAE. În concordanță cu inhibarea PPARγ prin suplimentarea cu SAE, suplimentarea pare să fi redus, de asemenea, nivelurile de ARNm de Pparg (Fig. 5D), precum și să fi activat semnificativ Ppara, un regulator al β-oxidării acizilor grași. Colectiv, aceste constatări indică faptul că suplimentarea cu SAE inhibă dezvoltarea ficatului gras indus de HFD prin reglarea genelor lipogene.

Discuţie

S-a descoperit că numeroase plante și condimente reduc nivelul glicemiei și greutatea corporală. Dintre aceste ierburi, S. aromaticum (familia Myrtaceae) este folosită nu numai ca supliment culinar în mai multe bucătării mondiale, ci și ca ajutor tradițional medicinal în tratamentul durerilor dentare, cefaleei și tulburărilor respiratorii din mai multe țări din Asia. Mai multe studii au raportat că S. aromaticum exercită o varietate de acțiuni farmacologice, inclusiv activități antioxidante, hipoglicemice și antiinflamatorii (7,10,11). Cu toate acestea, din câte știm, niciun studiu nu și-a examinat acțiunea asupra prevenirii obezității. Astfel, acest studiu și constatarea sa principală că adăugarea de SAE în dietă reduce greutatea corporală la șoarecii hrăniți cu HFD, indicând astfel potențialul său ca supliment natural anti-obezitate, sunt contribuții semnificative la cercetarea și literatura de specialitate în acest domeniu.

S-a constatat că diferențierea adipocitelor preadipocitelor 3T3-L1 depinde de genele implicate în calea adipogenă în timpul procesului de diferențiere (12). În modelele de adipocite cultivate, sa descoperit că SAE inhibă diferențierea adipocitelor în celulele 3T3-L1 într-o manieră dependentă de doză. Deși analiza rezultatelor testului in vitro efectuate în acest studiu nu a indicat faptul că suplimentarea cu SAE a afectat expresia genelor legate de adipogeneză, analiza rezultatelor Western blot a testului in vivo a arătat că a suprimat puternic o creștere a Masa WAT ​​la șoareci alimentați cu HFD prin reducerea expresiei PPARγ și SREBP-1. Analiza acestor rezultate indică faptul că suplimentarea cu SAE reduce masa WAT ​​printr-o reducere a adipogenezei, ducând la pierderea lipidelor și, astfel, sugerează cu tărie că suplimentarea cu SAE previne acumularea de lipide indusă de HFD în țesutul adipos epididimal prin reglarea adipogenezei.

Hrănirea cu HFD crește nivelurile serice de leptină și insulină, care sunt asociate cu consumul de energie, metabolismul glucozei și oxidarea acizilor grași (13). S-a constatat că suplimentarea cu SAE a redus semnificativ nivelurile serice de leptină și insulină la șoarecii hrăniți cu HFD, indicând faptul că SAE îmbunătățește aceste anomalii metabolice induse de HFD. Suplimentarea cu SAE a dovedit, de asemenea, că a scăzut creșterea indusă de HFD în greutatea ficatului și a lipidelor hepatice, precum și a nivelurilor de TC și TG, și constatarea susținută de rezultatele colorării H&E, care au indicat că suplimentarea cu SAE a redus acumularea de lipide hepatice. Investigația expresiei hepatice a genelor care reglează metabolismul lipidic a arătat că suplimentarea cu SAE a împiedicat în mod semnificativ reducerea Ppara și a suprimat expresia atât a factorului de transcripție lipogenică Pparg, cât și a proteinelor de reglare lipogenice, inclusiv CD36, SREBP-1 și PPARγ, reglând astfel expresia genelor care favorizează oxidarea acizilor grași. Aceste constatări sugerează că suplimentarea cu SAE îmbunătățește parametrii metabolici hepatici prin reglarea genelor legate de lipogeneză în ficat.

În timp ce aceste descoperiri oferă dovezi că suplimentarea cu SAE inhibă semnificativ obezitatea la șoarecii hrăniți cu HFD, este necesară o investigație suplimentară a compușilor activi responsabili de efectele anti-obezitate. Kuroda și colab. Au raportat recent că derivații de eugenol, inclusiv dehidrodieugenolul și dehidrodieugenolul B exercită efecte hipoglicemiante puternice prin activarea PPARγ la modelele diabetice (11). Contrar rezultatelor testului in vitro din acest studiu, Kuroda și colab. Au constatat că acești constituenți stimulează diferențierea preadipocitelor 3T3-L1 prin activarea PPARγ, indicând faptul că compușii necunoscuți din SAE în afară de dehidrodieugenol și dehidrodieugenol B pot inhiba activarea PPARγ și exercita anti-obezitate. efecte prin reglarea genelor legate de adipogen.

Colectiv, rezultatele acestui studiu oferă dovezi solide că suplimentarea cu SAE exercită un efect anti-obezitate asupra șoarecilor obezi induși de HFD prin reglarea genelor legate de metabolismul lipidelor în ficat și WAT într-un mod care are ca rezultat reducerea acumulării de lipide. Aceste rezultate susțin puternic potențialul SAE ca supliment anti-obezitate în reglarea greutății corporale.

Mulțumiri

Acest studiu a fost susținut de Proiectul Național de Tehnologie a Platformei Ministerului Economiei Cunoașterii din Coreea și Institutul de Cercetare Alimentară din Coreea.