Endocrinologie celulară

reticul

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex

DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • Departamentul de farmacoterapie, Școala de absolvire a științelor biomedicale, Universitatea Hiroshima, Minami-ku, Hiroshima, Japonia

Dovezi în creștere indică faptul că stresul reticulului endoplasmatic (stresul ER) este implicat în dezvoltarea sindromului metabolic. Cu toate acestea, tratamentele farmacologice care vizează stresul ER nu sunt bine înțelese. În studiul de față, am constatat că fluvoxamina, un inhibitor selectiv al recaptării serotoninei utilizat pentru depresie, poate atenua „rezistența la leptină” indusă de stresul ER, adică insensibilitatea la hormonul anti-obezitate leptină. Tratamentul cu tunicamicină, un reactiv care induce stresul ER, a provocat moartea celulară, care a fost semnificativ inhibată de fluvoxamină. Leptina activează semnalizarea JAK2 - STAT3. Stresul ER a provocat o afectare a fosforilării STAT3 indusă de leptină, care a fost inversată de fluvoxamină. Fluvoxamina ar fi un medicament nou sensibilizant la leptină, care vizează stresul ER.

Introducere

Materiale și metode

Materiale și reactivi

Tunicamicina a fost obținută de la Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Japonia). Leptina și fluvoxamina au fost obținute de la SIGMA (St. Louis, MO, SUA).

Cultură de celule

Celulele SH-SY5Y de neuroblastom uman au fost menținute în mediul Eagle modificat de Dulbecco, suplimentat cu 10% (v/v) ser fetal de vițel inactivat la căldură la 37 ° C în 5% CO2 umidificat și 95% aer.

Generarea de celule Ob-Rb Leptin-Transfectate

Construcția umană a receptorului de leptină Ob - Rb, un cadou de la Genentech Inc., a fost transfectată în celule SH-SY5Y și HEK293 folosind reactiv Lipofectamine Plus (Life Technologies Inc.) conform instrucțiunilor producătorului. Transfectanții stabili (celule SH-SY5Y - Ob - Rb și HEK293 - Ob - Rb) au fost obținuți prin selecție cu antibioticul G418 (Hosoi și colab., 2006).

Analiza Western Blot

Western blot a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (Hosoi și colab., 2010a, b). Celulele au fost spălate cu PBS rece ca gheața și lizate într-un tampon conținând 10 mM HEPES - NaOH (pH 7,5), 150 mM NaCI, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 10 μg/mL aprotinină, 10 μg/mL leupeptină, fluorură de fenilmetilsulfonil 1 mM (PMSF) și 1% NP-40 timp de 20 min. Lizatul a fost centrifugat la 15.000 rpm timp de 20 de minute la 4 ° C și supernatantul a fost colectat. Probele au fost fierte cu tampon laemmli timp de 3 minute, fracționate prin electroforeză pe gel de dodecilsulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) și transferate la 4 ° C în membranele de nitroceluloză. Membranele au fost incubate cu anti-phospho STAT3 (Tyr705: Cell Signaling; 1: 1.000), anti-STAT3 (Santa Cruz; 1: 1.000), anti-KDEL (StressGen; 1: 1.000) și anti-PARP (Santa Cruz ) .diluat la 1: 1.000) anticorpi urmati de un anticorp legat de peroxidaza anti-hrean. Peroxidaza a fost detectată prin chemiluminiscență utilizând un sistem de chemiluminescență îmbunătățit.

Experiment RNAi

Transfecțiile tranzitorii ale ARNsi au fost efectuate în celulele HEK293-Ob - Rb. Lipofectamina RNAiMAX (tehnologii Life) a fost utilizată pentru a transfecta siARN conform instrucțiunilor producătorului. Mediul Opti-MEM1 a fost utilizat pentru transfecție și concentrațiile finale de siARN au fost de 50 nM. Am doborât Sig-1R folosind următoarea secvență siARN: Sig-1R uman; 5′-CUC ACU AAC UGA GGC CUU UdTdT-3 ′. Am folosit MISSION siRNA Universal Negative Control (SIGMA; SIC-001) pentru transfecția de control ARNsi. Celulele au fost recoltate la 72 de ore după transfecție.

Testul de scurgere al lactatului dehidrogenază

Viabilitatea celulelor a fost estimată prin metoda de scurgere a lactatului dehidrogenază (LDH) utilizând un kit de detectare a citotoxicității (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Activitatea LDH a fost măsurată ca densitate optimă la 492 nm.

Animale

șoareci ob/ob au fost obținuți din Japan SLC (Hamamatsu, Japonia). Șoarecii au fost menținuți într-o cameră la 22-24 ° C sub un ritm constant zi-noapte și li s-a dat hrană și apă, ad libitum. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și aprobat de comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Hiroshima.

Măsurarea aportului alimentar

Șoareci femele ob/ob vechi de nouă săptămâni au fost adăpostiți individual înainte de acest experiment. La trei zile după izolare, soluție salină (5 ml/kg) ca manechin a fost injectată intraperitoneal (i.p.) timp de 3 zile, apoi am injectat leptină (1 mg/kg, i.p.) și/sau fluvoxamină (20 mg/kg). Toate tratamentele au fost începute la ora 18:00. Măsurarea aportului cumulativ de alimente a fost efectuată prin măsurarea greutății alimentelor la momentele specifice.

Statistici

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SE. Analiza statistică a fost efectuată folosind Student’s t-Test.

Rezultate

Fluvoxamina Reticulul endoplasmatic atenuat Moartea celulară indusă de stres

Deoarece fluvoxamina are o afinitate pentru Sig-1R (Narita și colab., 1996), iar Sig-1R este implicat în stresul ER (Hayashi și Su, 2007), am analizat dacă fluvoxamina ar putea atenua stresul ER. Tunicamicina (Tm) a fost utilizată pentru a induce în mod specific stresul ER. Așa cum se arată în Figura 1, am observat o creștere a GRP78 în celulele tratate cu tunicamicină, indicând stresul ER. În plus, tratamentul cu tunicamicină a cauzat scindarea PARP (Figura 1) și moartea celulară, astfel cum a fost evaluat prin testul de scurgere LDH (Figura 2). Rezultatele sugerează că tunicamicina induce apoptoza evocată de stres în celulele SH-SY5Y ale neuroblastomului uman. Pentru a evalua proprietățile farmacologice ale fluvoxaminei, am analizat în continuare efectul acesteia asupra morții celulare induse de stres ER. Celulele au fost pretratate cu fluvoxamină timp de 30 de minute și a fost analizată moartea celulară indusă de stresul ER (tunicamicină). Tratamentul cu fluvoxamină în monoterapie nu a afectat moartea celulară (Figura 2). Cu toate acestea, moartea celulară indusă de stres ER, atenuată în funcție de doză de fluvoxamină (Figura 2). Aceste rezultate sugerează că fluvoxamina poate atenua stresul ER.

Figura 1. Inductor specific al stresului ER, tunicamicină, expresie evocată GRP78 și clivaj PARP. Celulele SH-SY5Y au fost stimulate cu tunicamicină (Tm: 0,5 μg/ml) timp de 24 de ore. Nivelurile de exprimare GRP78 și scindarea PARP au fost analizate prin Western blot.

Figura 2. Fluvoxamina a atenuat moartea celulară indusă de stres ER. Celulele SH-SY5Y au fost pre-incubate cu fluvoxamină (FVX: 0,1 μ M, 0,3 μ M) timp de 1 oră și apoi stimulate cu tunicamicină (Tm: 0,5 μg/ml) timp de 36 ore. Activitatea LDH a fost măsurată ca indicator al citotoxicității. *P Cuvinte cheie: leptina, fluvoxamina, stresul reticulului endoplasmatic, STAT3, obezitate, depresie

Citare: Hosoi T, Miyahara T, Kayano T, Yokoyama S și Ozawa K (2012) Rezistența la leptină indusă de stres a reticulului endoplasmatic atenuat de fluvoxamină. Față. Endocrin. 3: 12. doi: 10.3389/fendo.2012.00012

Primit: 16 aprilie 2011; Acceptat: 12 ianuarie 2012;
Publicat online: 30 ianuarie 2012.

Arthur Donny Strosberg, Organizația de cercetare Scripps, SUA

Donghai Wu, Institutul de Biomedicină și Sănătate din Guangzhou, China
Timo Dirk Mueller, Universitatea din Cincinnati Metabolic Diseases Institute, SUA