Imunologie nutrițională

Editat de
Vida Abedi

Geisinger Health System, Statele Unite ale AmericiiΑ

Revizuite de
Vinul Eytan

Universitatea din Alberta, Canada

Marie Van Der Merwe

Universitatea din Memphis, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

maternă

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de Gastroenterologie și Hepatologie, Spitalul General, Universitatea de Medicină din Tianjin, Tianjin, China
  • 2 Departamentul de Patologie, Spitalul General, Universitatea de Medicină Tianjin, Tianjin, China

Fundal: Dovezile acumulate arată că dieta bogată în grăsimi este strâns asociată cu boala inflamatorie a intestinului. Cu toate acestea, efectele și mecanismele care stau la baza dietei materne bogate în grăsimi (MHFD) asupra susceptibilității descendenților la colită la vârsta adultă nu are confirmare.

Metode: Șoarecilor însărcinați C57BL/6 li s-a administrat fie un conținut ridicat de grăsimi (60 E% grăsime, grup MHFD), fie o dietă de control [10 E% grăsimi, grup de control matern (MCD)] în timpul gestației și alăptării. Au fost evaluate dezvoltarea intestinală, funcția de barieră mucoasă, microbiota și inflamația mucoasei descendenților în vârstă de 3 săptămâni. După înțărcare, toți șoarecii au fost hrăniți cu o dietă de control până la vârsta de 8 săptămâni, când a fost analizată microbiota. Puii au fost, de asemenea, tratați cu soluție DSS 2% timp de 5 zile și s-a evaluat severitatea colitei.

Rezultate: Descendenții din grupul MHFD au fost semnificativ mai grei decât cei din grupul MCD doar la vârsta de 2-4 săptămâni, în timp ce nu s-au găsit diferențe în greutatea corporală între cele două grupuri în alte momente de timp măsurate. În comparație cu grupul MCD, MHFD a inhibat semnificativ dezvoltarea intestinală și a întrerupt funcția de barieră la descendenții în vârstă de 3 săptămâni. Deși colorarea H&E nu a arătat nicio inflamație microscopică evidentă la ambele grupuri de descendenți în vârstă de 3 săptămâni, producția crescută de citokine inflamatorii a indicat că inflamația de grad scăzut a fost indusă în grupul MHFD. Mai mult, analiza fecală a descendenților în vârstă de 3 săptămâni a indicat faptul că compozițiile microbiotei și diversitatea au fost semnificativ modificate în grupul MHFD. Interesant este că după 5 săptămâni de consum de dietă martor în ambele grupuri, compoziția microbiotică a descendenților din grupul MHFD a fost încă diferită de cea din grupul MCD, deși diversitatea bacteriană a fost parțial recuperată la vârsta de 8 săptămâni. În cele din urmă, după tratamentul DSS la descendenții în vârstă de 8 săptămâni, MHFD a exacerbat în mod semnificativ severitatea colitei și a crescut producția de citokină proinflamatorie.

Concluzii: Datele noastre arată că MHFD la începutul vieții poate inhiba dezvoltarea intestinală, poate induce disbioză și inflamații de grad scăzut și poate duce la perturbarea barierei mucoasei intestinale la descendenți și poate spori colita indusă de DSS la maturitate.

Introducere

Incidența și prevalența IBD, o tulburare intestinală cronică mediată imunologic, incluzând colita ulcerativă (UC) și boala Crohn (CD), a crescut la nivel mondial, în special în Asia (1-3). Această evoluție epidemiologică a fost paralelă cu dietele și stilurile de viață occidentalizate (4). Patogeneza IBD rămâne necunoscută. Dovezi în creștere arată că dezvoltarea IBD este asociată cu susceptibilitatea genetică a gazdei (5), factori de risc de mediu (6) și disbioză intestinală (7, 8).

În ultimul timp, evenimentele din viața timpurie, inclusiv modul de naștere, alăptarea, dieta maternă și utilizarea antibioticelor sunt recunoscute ca factori de risc potențiali pentru IBD (6, 9, 10). Deși studii recente sugerează că mediul intrauterin și placenta nu sunt sterile așa cum se presupune odată, perioada de inițiere a colonizării microbiomilor nou-născuți rămâne obscură (11-13). În special la începutul vieții, compoziția și diversitatea microbiotei colonizate influențează profund dezvoltarea sistemului imunitar al gazdei și mențin sănătatea gazdei în viața ulterioară (14, 15). Studii recente au clarificat faptul că mai mulți factori, inclusiv mediul prenatal, modul de livrare și factorii postnatali, pot modela comunitățile microbiene ale nou-născuților la naștere și mai târziu (16). Microbiota maternă, inclusiv microbiota gastro-intestinală și microbiota vaginală, precum și compoziția laptelui matern joacă un rol esențial în colonizarea microbiomului nou-născutului (17).

Este de obicei acceptat faptul că dieta maternă este unul dintre factorii majori care influențează compoziția microbiană a descendenților (18-20). Interesant este că s-a dovedit că reglarea compoziției microbiotei materne prin suplimentarea cu probiotice sau prebiotice la începutul vieții oferă efecte benefice pentru tractul gastrointestinal neonatal (14, 21, 22). În contrast, atât dovezile epidemiologice, cât și datele experimentale sugerează că dieta maternă bogată în grăsimi (MHFD) în timpul gestației și alăptării ar putea duce la colonizarea bacteriilor patogene specifice și la creșterea în continuare a riscului de boli descendente (23-26). Un studiu recent a raportat că consumul matern bogat în grăsimi poate spori susceptibilitatea descendenților la colita indusă de Dextran sulfat de sodiu (DSS) (27). Cu toate acestea, mecanismele de bază și rolul microbiotei nu au fost definite. Având în vedere influența potențială a MHFD asupra descendenților, am emis ipoteza că MHFD ar putea induce perturbarea microbiotei intestinale și, astfel, poate exacerba susceptibilitatea descendenților la colită la vârsta adultă.

În studiul de față, rezultatele noastre au arătat că MHFD a modificat dezvoltarea intestinală și proliferarea celulară, a indus disbioză și inflamații de grad scăzut și a întrerupt funcția de barieră mucoasă la descendenți. Mai important, MHFD a modificat în mod semnificativ compoziția microbiotei intestinale a descendenților și a sporit în continuare susceptibilitatea la colita indusă de DSS la vârsta adultă. Aceste descoperiri sugerează că MHFD la începutul vieții poate avea un impact negativ asupra dezvoltării și funcției intestinale, precum și poate provoca o schimbare marcată a microbiotei intestinale și apoi predispune descendenții pentru a facilita dezvoltarea colitei. Prin urmare, acest studiu deschide posibilitatea de a înțelege patogeneza IBD la vârsta adultă indusă de MHFD la modelele animale.

Rezultate

MHFD a inhibat dezvoltarea intestinală a descendenților în viața timpurie

Studiile anterioare au demonstrat că obezitatea maternă sau dieta bogată în grăsimi pot contribui la obezitatea descendenților (28-30). În acest studiu, am constatat într-adevăr că descendenții din grupul MHFD au crescut ușor greutatea corporală la vârsta de 2-4 săptămâni, fără nicio diferență semnificativă în alte momente de timp măsurate (Figura 1B). Dată fiind dieta maternă este singurul factor variabil pentru puilor înainte de vârsta de 3 săptămâni, pentru alegerea efectului MHFD a fost ales un punct cheie de cotitură.

Analiza PCR în timp real

ARN-ul total a fost extras folosind mini-kitul RNeasy (Qiagen, Carlsbad, CA, SUA) urmat de transcripția inversă a ADNc utilizând kitul TIANScript RT (TIANGEN, Inc. Beijing, China) conform protocolului producătorului. Analiza PCR în timp real a fost efectuată folosind Taqman Gene Expression Master Mix și primele (GENEWIZ, Inc. Beijing, China). Primerii oligonucleotidici pentru genele țintă au fost enumerați în tabelul 1. Gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) a fost utilizată ca martor endogen. Nivelurile relative de expresie a ARNm ale genei țintă au fost evaluate prin calculul modificărilor de ori normalizate la GAPDH pentru fiecare probă folosind 2 −CT metodă. Toate probele de ADNc au fost analizate în triplicat.

tabelul 1. Primerii oligonucleotidici utilizați în analiza PCR în timp real.

Western Blotting

Țesuturile colonice au fost dizolvate în tampon RIPA cu inhibitori de protează (Solarbio, Beijing, China). După omogenizare, concentrațiile de proteine ​​au fost determinate prin testul proteinei acidului bicinchoninic (Thermo Scientific Inc). Proteinele au fost separate folosind un sistem de electroforeză pe gel SDS-poliacrilamidă și apoi șterse pe o membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF) (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Ulterior, s-au aplicat anticorpul anti-CLDN3 primar (iepure, antimouse, Cell Signaling Technology), anti-ZO-1 (iepure, antimouse, Cell Signaling Technology) și anti-β-actină (iepure, antimouse, Cell Signaling Technology); anticorpul anti-β-actină a fost utilizat ca control al încărcării. După incubare cu peroxidază de hrean (HRP) - anticorpi secundari conjugați (tehnologie de semnalizare celulară), a fost detectat semnalul chemiluminiscent. Intensitatea benzii a fost determinată de programul procesorului de imagine (imaginea J).

Măsurarea sigA fecală

Probele de fecale au fost omogenizate prin plasarea în tampon de omogenizare (soluție salină tampon fosfat (PBS) conținând 0,05% Tween 20 și cocktail inhibitor de protează) timp de 15 minute la 5.000 rotații pe minut. Ulterior, omogenatele au fost centrifugate scurt și supernatantele au fost înghețate la 20 ° C negative pentru testele ulterioare. Standarde și probe fecale au fost adăugate la godeul corespunzător al plăcii de microtitrare pre-acoperite cu anticorpi IgA anti-șoarece de polistiren cu 96 de godeuri (Sigma-Aldrich) conform instrucțiunilor producătorului. Toate probele au fost testate în duplicat și s-a calculat densitatea optică medie (DO).

Colorare periodică a acidului Schiff (PAS)

Secțiunile colonice deparafinate au fost incubate cu soluție de acid periodic 1% (Sigma-Aldrich) timp de 10 min, urmată de colorare în reactiv Schiff (Sigma-Aldrich) timp de 40 min. Ulterior, secțiunile colorate cu PAS au fost contracolorate cu hematoxilină timp de 2-5 min. Soluția PBS a fost utilizată ca tampon de spălare pentru clătire în fiecare etapă.

Histologie și imunohistochimie

Țesuturile intestinale au fost fixate în soluție de formalină 4%, încorporate în parafină și tăiate în felii de 4 μm. După deparafinare și hidratare, s-a efectuat colorarea H&E pentru evaluarea dezvoltării și inflamației intestinale. Dezvoltarea intestinală a fost evaluată prin măsurarea lungimii vilozității/criptei. Trei sute de villi/cripte bine orientate, alese la întâmplare din × 200 de imagini, au fost observate și măsurate la microscopul luminos SZX16 (Olympus, Japonia) pentru fiecare șoarece.

Pentru imunohistochimie, secțiunile deparafinizate au fost incubate cu anticorpi primari anti-Ki67 monoclonali de iepure (ab16667, Abcam, Cambridge, MA, SUA) și anti-MUC2 de iepure (Santa Cruz Biotechnology, Inc) peste noapte la 4 ° C. După spălare în PBS, secțiunile au fost incubate în continuare cu anticorpul secundar anti-iepure biotinilat (Santa Cruz Biotechnology, Inc) timp de 30 de minute urmate de contracolorare cu 3, 3'-diaminobenzidină. Expresia Ki67 și MUC2 a fost detectată prin numărarea numărului absolut de celule colorate pozitiv. Cinci zone aleatorii din imagini × 400 au fost efectuate la microscopul cu lumină DM5000 B (Leika, Germania) în cel puțin 100 de vilozități sau cripte pentru fiecare șoarece.

Colorare imunofluorescentă

Intestinul subțire fixat în formalină și țesuturile colonului au fost încorporate în parafină și tăiate în secțiuni de 4 μm. După deparafinare și hidratare, secțiunile au fost incubate 15 minute cu soluție de demascare a antigenului (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA, SUA) pentru recuperarea antigenului. Ulterior, 5% BSA a fost utilizat pentru a bloca legarea nespecifică. Apoi secțiunile intestinului subțire au fost incubate cu anticorp specific anti-IgA primar (ab223410, Abcam, Cambridge, MA, SUA), iar secțiunile colonice au fost incubate cu anticorpul anti-ZO-1 primar specific (ab96587, Abcam, Cambridge, MA, SUA) peste noapte la 4 ° C. Ulterior, secțiunile au fost spălate cu 1 × PBS timp de 5 minute de trei ori și incubate cu anticorpi secundari conjugați cu fluorocrom IgG H&L anticorp secundar fluorescent (Santa Cruz Biotechnology, Inc) și ALEXA FLUOR 488 (FITC) anticorp secundar (Santa Cruz Biotechnology, Inc .)) la temperatura camerei în întuneric timp de 60 min. DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) a fost aplicat în cele din urmă pentru vopsirea nucleului. Fotografiile de fluorescență au fost obținute la microscopul de fluorescență DM5000 B (Leika, Germania). Imaginile FITC și DAPI au fost luate dintr-o zonă unificată. A fost efectuată analiza cantitativă a colorării imunofluorescente pentru IgA (81). Au fost numărate celule IgA pozitive în 300 de vilozități.

Colita indusă de sulfat de sodiu Dextran (DSS)

DSS (36-50kDa, MP Biomedicals) a fost dizolvat în apă potabilă și șoarecii în vârstă de 8 săptămâni au fost hrăniți cu soluție DSS 2% timp de 5 zile. Șoarecii din ambele grupuri au primit apă de la robinet ca control pentru tratamentul DSS. Soluțiile DSS au fost schimbate în fiecare zi pentru a fi păstrate proaspete până la sfârșitul experimentului. Pentru determinarea severității colitei a fost aplicat un sistem de notare a indicelui activității bolii (DAI) care constă în modificări ale pierderii în greutate a animalelor, prezenței sângelui ocult sau brut pe rect și consistenței scaunului. Șoarecii au fost sacrificați și întregul colon a fost rapid excizat, deoarece lungimea colonului a fost măsurată ca un marker pentru inflamație. Țesutul colonic a fost fie stocat la -80 ° C până când a fost utilizat pentru analiza profilurilor citokinelor inflamatorii sau fixat în formalină tamponată 10% și încorporat în parafină pentru colorarea H&E. Deteriorarea histologică a fost evaluată ca un scor combinat al gradului de inflamație (scara de 0-3), procentul de suprafață implicată de inflamație (0-4), deteriorarea criptelor (0-4) și adâncimea inflamației (0-3) ).) într-un mod orbit de un patolog (YJZ).

Analize statistice

Datele au fost prezentate ca medie ± SEM. Semnificația statistică a diferențelor a fost testată de ANOVA unidirecțională în mai multe grupuri și t-teste pentru eșantioane împerecheate folosind SPSS 22.0 (SPSS, Chicago, IL, SUA). Toate diferențele au fost considerate semnificative statistic la p Cuvinte cheie: dietă maternă bogată în grăsimi, descendenți, dezvoltare intestinală, microbiotă, colită

Citație: Xie R, Sun Y, Wu J, Huang S, Jin G, Guo Z, Zhang Y, Liu T, Liu X, Cao X, Wang B și Cao H (2018) Dieta maternă bogată în grăsimi modifică microbiota intestinală a descendenților și Exacerbează colita indusă de DSS la vârsta adultă. Față. Immunol. 9: 2608. doi: 10.3389/film.2018.02608

Primit: 05 iunie 2018; Acceptat: 23 octombrie 2018;
Publicat: 13 noiembrie 2018.

Vida Abedi, Geisinger Health System, Statele Unite

Eytan Wine, Universitatea din Alberta, Canada
Marie Van Der Merwe, Universitatea din Memphis, Statele Unite

† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare