Diabet clinic

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Gestionarea diabetului de tip 2: un accent pe defectele metabolice Vizualizați toate cele 15 articole

Editat de
Zilin Sun.

Spitalul Zhongda, Universitatea de Sud-Est, China

Revizuite de
Patricia Seoane-Collazo

Universitatea din Santiago de Compostela, Spania

Lixin Li

Universitatea Central Michigan, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

ginsenoside

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de boli endocrine și metabolice, primul spital afiliat al Universității medicale Wenzhou, Wenzhou, China
  • 2 Departamentul de patologie, primul spital afiliat al Universității medicale Wenzhou, Wenzhou, China

Introducere

Cu plasticitatea adipocitelor bej pentru a spori consumul de energie și termogeneza sub stimuli, s-au făcut eforturi masive pentru a căuta inductori puternici pentru efectele de rumenire ale grăsimilor albe. În afară de câțiva candidați promițători, cum ar fi factorul de creștere a fibroblastelor 21 (FGF21) și irisina (10, 11), ingredientele active din medicina tradițională chineză (TCM) oferă un spectru larg de opțiuni și prezintă un potențial mare. De exemplu, studii independente au arătat că compuși precum berberină, resveratrol, artemisinină și celastrol provenind de la TCM ar putea îmbunătăți funcția grăsimii brune și ar putea induce rumenirea WAT ​​prin reglarea transcripțională și post-transcripțională a nodurilor moleculare de reglare metabolice critice, cum ar fi Protein kinaza activată cu AMP (AMPK), regulatorul de informație silențios 1 (SIRT1), receptorul activat cu proliferatorul peroxizomului gamma coactivator-1a (PGC1a) și factorul de șoc termic 1 (HSF1) (12).

Plantele de ginseng sunt folosite ca medicament antic în China de mii de ani pentru a consolida sănătatea holistică. Ca ingrediente farmacologice majore în plantele de ginseng, ginsenozidele posedă multiple proprietăți farmacologice, inclusiv anti-oxidative, anti-îmbătrânire, anti-cancer și alte acțiuni de îmbunătățire a sănătății (13). Pentru aspectele metabolice, cercetările au arătat că ginsenozidele au redus greutatea corporală (14), au prevenit steatoza hepatică (15), au crescut sensibilitatea la insulină (16), au restabilit dinamica mitocondrială (17) și au atenuat răspunsul hepatic al glucagonului (18). Deoarece cea mai abundentă saponină conținută în ginsengul Panax (19), s-a raportat că Ginsenoside Rb2 (Rb2) ameliorează acumularea de lipide hepatice în șoarecii obezi induși de dietă bogată în grăsimi (HFD) (20), scade glicemia la șobolanii diabetici induși de streptozotocină (21), și niveluri mai scăzute de triacilglicerol în adipocite 3T3-L1 (22). Recent am arătat că Rb2 a redus adipozitatea și a îmbunătățit sensibilitatea la insulină la șoarecii obezi prin fosforilarea AKT și a inhibat calea de semnalizare NF-κB în țesuturile adipoase albe și în adipocitele 3T3-L1 (23). Cu toate acestea, efectele și mecanismele prin care Rb2 ameliorează obezitatea nu au fost pe deplin elucidate, în special în ceea ce privește efectele Rb2 asupra grăsimii maro și bej.

În studiul de față, am investigat performanțele metabolice cu suplimentul Rb2 la șoarecii obezi induse de dietă (DIO) și am demonstrat că Rb2 a redus în mod eficient greutatea corporală, a îmbunătățit sensibilitatea la insulină și a crescut cheltuielile de energie la șoarecii DIO. Analiza detaliată a demonstrat că Rb2 a indus activarea grăsimii brune și rumenirea grăsimii albe, așa cum se arată prin reducerea picăturilor de lipide, creșterea colorării UCP1 și creșterea programelor genetice brune, care ar putea fi recapitulate in vitro. În plus, Rb2 a indus fosforilarea AMPK în timp ce activarea AMPK este dispensabilă pentru efectele benefice ale Rb2. În general, prezentul studiu a relevat că Rb2 ameliorează obezitatea și tulburările metabolice prin activarea grăsimii brune și inducerea rumenirii grăsimilor albe, ceea ce duce la creșterea cheltuielilor de energie și a termogenezei. S-a sugerat că Rb2 este un compus benefic promițător care tratează obezitatea.

Materiale și metode

Produse chimice și anticorpi

Ginsenozida Rb2 (puritate> 98,0%) a fost achiziționată de la Shanghai Yuanye Biotech Co., Ltd. (Shanghai, MO, China). Compusul inhibitor AMPK C (10 mM; puritate = 99,67%) a fost de la Selleck Chemicals (S7306). Șoarecii HFD (60% kcal din untură; MD12033) și zaharoza s-au potrivit cu o dietă de control cu ​​conținut scăzut de grăsimi (10% kcal din untură; MD12031) au fost obținuți din Research Diets. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Dulbecco's Modified Eagle Media: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Medium și Fetal Bovine Serum (FBS) au fost obținute de la Sigma-Aldrich (San José, CA, SUA). Pudră de insulină, pulbere T3, colagenază de tip II clostridium histolyticum, indometacină, izobutil-1-metilxantină (IBMX) și dexametazonă au fost obținute de la Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, SUA). Anticorpii primari (anti-AMPK și anti-p-AMPK) au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology (Beverly, MA, SUA).

Animale

Toți șoarecii C57BL/6J (masculi, în vârstă de 8 săptămâni) au fost adăpostiți într-un ciclu constant de 12 ore lumină/întuneric, cu acces gratuit la apă și chow standard sau HFD timp de 9 săptămâni. Șoarecii au fost obținuți de la Shanghai Slake Experimental Animal CO.LTD. Și au fost menținuți la 22 ± 2 ° C cu 60 ± 5% umiditate relativă. HFD și șoarecilor hrăniți cu dietă Chow li s-a administrat o injecție intraperitoneală de Rb2 (40 mg/kg/zi) sau PBS (vehicul) între 16:00 și 17:00 zilnic. Greutatea corporală a fost monitorizată o dată pe săptămână între săptămâna 9 și o dată pe zi pe parcursul unui curs de tratament de 10 zile. Țesuturile și serul au fost colectate, congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C. BAT a fost separată de regiunea interscapulară; eWAT (epididim WAT) a fost obținut din epididim; iWAT (WAT subcutanat) a fost disecat din stratul de sub piele și în afara cavității abdominale la șolduri. Masa grasă a fost suma BAT, eWAT și iWAT. Experimentele au fost randomizate. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Universitatea Medicală Wenzhou (nr: SYXK-2015-0009).

3T3-L1, C3H10T1/2 Adipocite și șoareci Fracția stromal-vasculară primară (SVF) Cultura și diferențierea

Celulele 3T3-L1 și C3H10T1/2 au fost achiziționate de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, SUA) și au fost menținute în DMEM cu amestec de 10% FBS la 37 ° C într-un mediu de 5% CO2. Șoarecii SVF au fost izolați din iWAT la șoareci masculi C57BL/6J cu vârsta de 6-8 săptămâni. Izolarea SVF a fost efectuată anterior (24, 25). Pe scurt, țesuturile au fost tăiate, digerate cu 1 mg/ml colagenază în PBS suplimentat cu 0,5% albumină serică bovină (BSA) și 10 mM amestec Hepes timp de 30 de minute, cu agitare de 300 rpm la 37 ° C. Suspensia a fost strecurată printr-o plasă de nailon 40 μM (Falcon), colectată prin centrifugare. În cele din urmă, adipocitele au fost apoi cultivate în DMEM/F12 conținând 10% amestec FBS și plasate într-un incubator la 37 ° C cu un mediu de 5% CO2.

După atingerea confluenței 100%, celulele 3T3-L1, C3H10T1/2 și șoarecii SVF au fost stimulați pentru a diferenția un cocktail hormonal conținând insulină 50 nM, 100 nM T3, 0,125 mM indometacină, 2 μg/ml dexametazonă și 0,5 mM IBMX. După 48 de ore, adipocitele au fost mutate în mediul conținând 50 nM insulină și 1 nM T3. Mediul a fost înlocuit la fiecare 2 zile înainte de tratamentul cu Rb2. Soluția de dimetil (DMSO) a fost utilizată ca tratament pentru vehicul. În cele din urmă, adipocitele mature au fost confirmate prin microscopie cu lumină și colorare cu ulei roșu O și apoi utilizate pentru analize suplimentare.

Ulei Roșu O colorare

Picăturile de lipide prezente în adipocite au fost dovedite prin colorarea cu ulei roșu O (Sigma). Oil Red O a fost diluat în apă pentru a obține o soluție de lucru de 60% și apoi filtrat printr-o hârtie de filtru. Adipocitele au fost fixate în 4% formalină tamponată neutră timp de 30 de minute la temperatura camerei. S-a adăugat soluția Oil Red O (1,5 ml) și s-a menținut la temperatura camerei timp de 15 min. Soluția a fost refuzată, iar godeurile au fost spălate cu PBS de mai multe ori până când fundalul a fost clar. În cele din urmă, adipocitele au fost realizate cu ajutorul microscopiei cu lumină.

Testul de toleranță la glucoză (GTT) și testul de toleranță la insulină (ITT)

Au fost urmate metode anterioare pentru implementarea GTT și ITT. GTT a fost efectuat la șoareci masculi C57BL/6J după un post peste noapte. Concentrațiile de glucoză din sânge au fost măsurate din vena cozii imediat la 0, 15, 30, 45, 60, 90 și 120 de minute după un 0,75 g/kg i.p. s-a administrat injecție de glucoză (7). Alimentele au fost îndepărtate timp de 2 ore înainte de efectuarea ITT. După un 0,75 U/kg i.p. injectarea de insulină umană (Eli Lilly) a fost administrată șoarecilor, concentrațiile de glucoză au fost evaluate la 0, 15, 30, 45 și 60 de minute (26).

Analiza cheltuielilor energetice

Cheltuielile de energie au fost determinate folosind un sistem de monitorizare completă a animalelor de laborator (sistemul CLAMS, Columbus Instruments) conform instrucțiunilor producătorului. Animalele au fost aclimatizate la sistem timp de 24 de ore înainte de măsurarea VO2 și VCO2. Șoarecii au fost menținuți la 22 ° C într-un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Au fost disponibile alimente și apă ad libitum. Producția de căldură a fost calculată conform următoarei ecuații:

unde căldura este măsurată în kcal h -1, VO2 și VCO2 sunt măsurate în litri kg -1 -1 h -1 și greutatea corporală este măsurată în kg (27).

Analiza histologică și imunofluorescență

Țesuturile fixate în paraformaldehidă de 4% au fost secționate după ce au fost încorporate parafină. Mai multe secțiuni au fost pregătite și colorate cu hematoxilină și eozină pentru observații morfologice generale. Colorarea prin imunofluorescență a fost efectuată conform protocoalelor standard utilizând următorii anticorpi și diluții: UCP1 (Abcam) și respectiv 1: 400. Incubațiile au fost efectuate peste noapte într-o cameră umidificată la 4 ° C. Anticorpii secundari pentru colorarea imunofluorescenței au fost cumpărați de la Invitrogen. Colorarea hematoxilinei a fost utilizată pentru a marca nucleele celulare. Mai întâi s-a efectuat colorarea prin imunofluorescență și s-au captat imagini imunofluorescente. În cele din urmă, imaginile au fost achiziționate folosind un sistem Olympus BX51. Iar imaginea J a fost utilizată pentru a calcula dimensiunea adipocitelor.

Test de toleranță la rece

În a 10-a zi după tratamentul cu PBS sau Rb2, șoarecii au fost apoi supuși unei camere reci (4 ° C) timp de 24 de ore fără acces la alimente sau apă. Temperatura rectală a șoarecilor a fost măsurată la 0, 30, 60 și 120 min începând la expunerea la rece cu termometrul de monitorizare Th5 Thermalert (Braintree, SUA). Analizele histologice și moleculare au fost efectuate după expunerea la rece de 24 de ore.

Analiza Western Blot

Adipocitele au fost recoltate în soluție de extracție a proteinelor (Solarbio) și incubate timp de 30 de minute la 4 ° C. După ce resturile celulare au fost îndepărtate, proteinele care conțin supernatant au fost colectate și determinate folosind kitul de testare a proteinelor Pierce BCA conform instrucțiunilor producătorului. Apoi, 40 μg de proteine ​​au fost separate de 10% SDS-PAGE și transferate în membranele PVDF. Bloturile au fost incubate utilizând o soluție de blocare a laptelui 5% la temperatura camerei peste noapte cu un anticorp primar împotriva AMPK și p-AMPK. Bloturile au fost apoi spălate cu TBST și incubate cu anticorpul secundar conjugat cu peroxidază de hrean (1: 5000) timp de o oră. În cele din urmă, bloturile au fost dezvoltate folosind un kit de chemiluminescență îmbunătățit (Salarbio) în conformitate cu protocoalele producătorului.

Analiza PCR cantitativă în timp real

ARN-ul total a fost izolat din celule utilizând Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) și a fost transcris invers în ADNc din prima catenă utilizând sistemul de transcripție inversă (A3500, Promega, Madison, WI). Pentru a analiza expresia genelor, s-a efectuat PCR cantitativă în timp real folosind un instrument ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). La cerere au fost furnizate grunduri.

Analize statistice

Datele au fost exprimate ca medie ± SEM din cel puțin trei experimente independente. Analizele au fost efectuate utilizând Graph Pad Prism 5 și SPSS versiunea 20.0. Pentru măsurători repetate (de exemplu, greutatea corporală), au fost efectuate testele multiple de comparație ale lui Dunnett. Pentru măsurarea punctului de timp unic, analizele statistice au fost efectuate utilizând un student nepereche t-test pentru două grupuri și o analiză unidirecțională a varianței (ANOVA) pentru mai mult de două grupuri. P ≤ 0,05 a fost considerat semnificativ statistic.

Rezultate

Tratamentul Rb2 a redus greutatea corporală și a îmbunătățit sensibilitatea la insulină la șoarecii DIO

Pentru a evalua efectele Rb2 în tratarea obezității, am stabilit mai întâi un model de șoareci DIO hrănind șoareci timp de 9 săptămâni. Acest lucru a dus la o creștere semnificativă a greutății corporale la aproximativ 40 de grame în comparație cu hrănirea chow (Figurile S1A, S1B). Foarte important, 10 zile de tratament cu Rb2 au scăzut în mare măsură greutatea corporală la acești șoareci DIO, în timp ce nu afectează greutatea corporală la șoarecii hrăniți prin dieta chow (Figurile 1A, B, Figura S1C). Aportul alimentar la șoarecii tratați cu Rb2 a arătat o ușoară tendință descendentă, dar nu au existat diferențe semnificative în comparație cu grupul martor (Figura S1D). Între timp, am constatat că șoarecii DIO suplimentați cu Rb2 aveau o toleranță mai bună la încărcarea cu glucoză și erau mai sensibili la adăugarea insulinei, care au fost arătați în analizele GTT și ITT (Figurile 1C - F, Figurile S1E - S1H). Prin urmare, aceste rezultate au demonstrat că Rb2 ar putea reduce greutatea corporală și ar putea îmbunătăți sensibilitatea la insulină la șoarecii DIO.

figura 1. Tratamentul cu Rb2 a redus greutatea corporală și a îmbunătățit sensibilitatea la insulină la șoarecii DIO. (A) Fotografie reprezentativă a șoarecilor DIO după injectarea intraperitoneală de PBS sau Rb2 timp de 10 zile. (B) Greutatea corporală a șoarecilor DIO tratați cu sau fără Rb2 timp de 10 zile (n = 6). (C - F) Spectacole ale GTT (C) și ITT (E) de șoareci DIO tratați cu sau fără Rb2. Zona de sub curba (AUC) a GTT și ITT a fost, de asemenea, prezentată ca D și F. N = 6 per grup. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM și *P # P ## P # P # P ## P # P ## P Cuvinte cheie: Ginsenoside Rb2, obezitate, rumenire, UCP1, AMPK

Citare: Hong Y, Lin Y, Si Q, Yang L, Dong W și Gu X (2019) Ginsenoside Rb2 ameliorează obezitatea prin activarea grăsimii brune și inducerea rumenirii grăsimilor albe. Față. Endocrinol. 10: 153. doi: 10.3389/fendo.2019.00153

Primit: 04 decembrie 2018; Acceptat: 21 februarie 2019;
Publicat: 15 martie 2019.

Zilin Sun, Spitalul Zhongda, Universitatea de Sud-Est, China

Patricia Seoane-Collazo, Universitatea din Santiago de Compostela, Spania
Lixin Li, Central Michigan University, Statele Unite

† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare