Analiza mutației și studiul populației

  1. Federica Sentinelli 1,
  2. Stefano Romeo 1,
  3. Marcello Arca 2,
  4. Emanuela Filippi 1,
  5. Frida Leonetti 1,
  6. Michela Banchieri 1,
  7. Umberto Di Mario 1 și
  8. Marco Giorgio Baroni 1

  1. 1 Departamentul de Științe Clinice, Divizia de Endocrinologie, Universitatea din Roma „La Sapienza”, Roma, Italia
  2. 2 Institutul Teratia Medica Sistematica, Universitatea din Roma „La Sapienza”, Roma, Italia

Acest articol are o corecție. Te rog vezi:

Analiza mutației și studiul populației

Abstract

Tulburările frecvente, cum ar fi diabetul de tip 2, hipertensiunea și ateroscleroza prematură recunosc rezistența la insulină ca factor patogen de bază. Hiperinsulinemia și intoleranța la glucoză sunt adesea prezente în obezitate și din nou acțiunea defectuoasă a insulinei este considerată factorul principal. Transmisia familială și variațiile distribuției etnice sugerează că rezistența la insulină este determinată genetic. Cu toate acestea, în ciuda dovezilor puternice în favoarea unei componente genetice, defectele responsabile de rezistența la insulină nu au fost încă identificate.

umane

Foarte recent, noua descoperire a rezistenței hormonale a fost sugerată pentru a lega obezitatea de diabet (1). La modelele animale, rezistina este secretată în mod specific de adipocite și este crescută semnificativ atât în ​​obezitatea genetică, cât și în cea obținută din dietă. Creșterea secreției de resistină a fost corelată cu toleranța la glucoză afectată și acțiunea insulinei la șoareci, în timp ce tratamentul cu tiazolidinedionă a reglat mult expresia genei rezistinei, iar neutralizarea proteinei rezistinei a îmbunătățit absorbția glicemiei și sensibilitatea la insulină. S-a sugerat că rezistina antagonizează insulina, modulând unul sau mai mulți pași în calea de semnalizare a insulinei și, eventual, jucând un rol în patogeneza rezistenței la insulină. Astfel, gena rezistinei reprezintă un potențial candidat pentru etiologia rezistenței la insulină și a diabetului de tip 2, deși expresia genei rezistinei în celulele grase și țesutul adipos de la subiecții supraponderali a fost raportată a fi aproape absentă (2), punând întrebarea despre rolul rezistinei în obezitatea umană și diabetul controversat.

Pentru a stabili dacă variațiile genetice ale genei rezistinei ar putea contribui la rezistența la insulină, secvența codificatoare a celor trei exoni ai genei rezistinei, împreună cu regiunea sa de reglare 5 ′ și 3′-UTR, a fost analizată de SSCP (3) în tipul 2 pacienții diabetici și subiecții obezi.

Un total de 177 de subiecți au fost selectați pentru variantele de secvență din gena rezistenței. Grupul a inclus 58 de subiecți diabetici de tip 2, 59 subiecți obezi și 60 subiecți de control normal. Secvența ADNc a genei rezistinei (AF323081) a fost aliniată cu BLAST 2 la secvența de schiță a clonei umane 19 clonă CTD-3214H19 (AC008763) pentru a determina limitele intron/exon. Gena rezistinei umane este codificată într-un segment de 1,3 kb pe cromozomul 19 (1), iar transcriptul 476-nucleotidic este conținut în trei exoni. Au fost utilizate trei perechi de grund pentru a amplifica cei trei exoni, regiunea de reglare 5 'și 3'-UTR (Tabelul 1). O singură variantă de secvență a fost detectată în exonul 3 al genei rezistinei. Această variantă a fost găsită la 2 din 58 de subiecți diabetici (2 homozigoti) și la 4 din 59 subiecți obezi (2 homozigoti și 2 heterozigoți); nu a fost găsit la niciunul dintre subiecții de control. Secvențierea variantei a relevat prezența unei substituții SNP în 3'-UTR a exonului 3 (G1326C), 60 bp 3 ′ de la codonul de oprire și 8 bp 5 ′ de la semnalul de poliadenilare AATAAA.

S-a demonstrat că SNP-urile din 3'-UTR ale genelor pot afecta expresia genelor (4,5) și este posibil ca această variantă G1326C din 3'-UTR a genei rezistinei să aibă o influență asupra expresiei genei rezistenței. Prin urmare, am examinat frecvența acestui SNP la subiecți obezi, diabetici și normali.

Un total de 591 subiecți (198 subiecți obezi, 207 subiecți diabetici și 186 subiecți martori) au fost studiați pentru prezența variantei G1326C a genei rezistinei prin amplificarea PCR și digestia enzimei de restricție BseRI.

Caracteristicile clinice ale subiecților studiați sunt prezentate în Tabelul 2. Subiecții obezi au fost semnificativ mai tineri decât subiecții diabetici și de control. IMC a fost semnificativ diferit între cele trei grupuri (analiza P 2). Frecvența alelei G1326C nu a fost semnificativ diferită între toate grupurile. Pentru a testa dacă SNP G1326C ar putea fi asociat cu oricare dintre fenotipurile legate de obezitate sau diabet, în special indicii de rezistență la insulină, am comparat parametrii clinici și metabolici (IMC, glicemie, insulină, HOMAIR și profil lipidic) între purtători și non-purtători ai G1326C SNP. Din nou, nu s-a găsit nicio diferență semnificativă (datele nu sunt prezentate).

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Pacienți.

Screening genetic molecular.

Variantele de secvență ale genei rezistinei au fost analizate cu tehnica PCR-SSCP așa cum s-a descris anterior (3). Pe scurt, primerii au fost proiectați pentru a include limitele intron-exon, pentru a evalua posibile mutații în siturile de îmbinare și pentru a include regiunea de reglare 5 'și 3'-UTR (Tabelul 1). Pentru a confirma secvența nucleotidică așteptată, cele trei fragmente PCR corespunzătoare celor trei exoni au fost analizate prin secvențierea directă folosind kitul PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing și un secvențiator automat ABI 310 (Applied Biosystems, Milano, Italia) conform instrucțiunilor producătorului.

După amplificarea PCR, fragmentele de ADN au fost electroforizate în 1 × MDE (Mutation Detection Enhancement) gel (FMC BioProducts, Rockland, Maine) și vizualizate cu colorare cu argint. Toți exonii care nu prezintă variante SSCP cu această metodă au fost electroforați într-un gel de poliacrilamidă 12% în 1 × tampon TBE și au funcționat la temperatura camerei la o constantă de 25 mA timp de 14-16 ore, cu și fără 5% glicerol.

Variantele SSCP au fost investigate prin secvențierea directă așa cum s-a descris mai sus. Se raportează că metoda SSCP (11) are o sensibilitate de 90% atunci când este utilizată, ca în acest studiu, cu două condiții de gel; astfel, trebuie recunoscut faptul că există 10% șanse ca SNP-urile necunoscute să fi fost ratate.

Prin utilizarea Webcutter 2.0 (www.firstmarket.com/cutter/cut2.html), s-a constatat că varianta G1326C din exonul 3 al genei rezistinei creează un situs de restricție BseRI, rezultând prezența a două benzi de 235 și 21 pb . Astfel, digestia enzimei de restricție a fragmentului PCR de 256 bp al exonului 3 a fost efectuată la 37 ° C timp de 1,5 ore în reacții de 22 μl conținând 12 μl produs PCR, 2,2 μl tampon și 6 unități ale enzimei de restricție BseR1. Fragmentele au fost analizate pe 4% gel de înaltă rezoluție colorat cu bromură de etidiu.

analize statistice.

Variabilele categorice au fost comparate prin χ 2 sau testul exact al lui Fisher. Diferențele dintre variabilele continue au fost evaluate prin testul t Student cu două cozi. Distribuțiile genotipului între grupurile de studiu au fost comparate prin tabele de contingență 2 × 2 și 2 × 3 și analiza χ 2.