Sébastien Lebreton

1 unitate de ecologie chimică, Departamentul de biologie fitosanitară, Universitatea suedeză de științe agricole, Alnarp, Suedia

Peter Witzgall

1 unitate de ecologie chimică, Departamentul de biologie fitosanitară, Universitatea suedeză de științe agricole, Alnarp, Suedia

Marie Olsson

2 Unitate de calitate a produselor vegetale, Departamentul de Creștere a Plantelor, Universitatea Suedeză de Științe Agricole, Alnarp, Suedia

Paul G. Becher

1 unitate de ecologie chimică, Departamentul de biologie fitosanitară, Universitatea suedeză de științe agricole, Alnarp, Suedia

Abstract

Ajustarea comportamentului de hrănire ca răspuns la foame și sațietate contribuie la reglarea homeostatică la animale. Musca fructului Drosophila melanogaster se hrănește cu drojdii care cresc din fructe prea coapte, oferind nutrienți necesari supraviețuirii adulților, reproducerii și creșterii larvelor. Aici, vă prezentăm date despre modul în care valoarea nutrițională a alimentelor afectează consumul ulterior de drojdie la bărbații adulți Drosophila. După o perioadă de foame, muștele au prezentat un consum intensiv de drojdie. În comparație, muștele au încetat să se hrănească după ce au avut acces la o dietă nutritivă din făină de porumb. Interesant este că glucoza alimentară a fost la fel de eficientă ca și dieta complexă din făină de porumb. În schimb, muștele hrănite cu sucraloză, un îndulcitor nemetabolizabil, s-au comportat de parcă ar fi murit de foame. Hormonul adipokinetic și peptidele asemănătoare insulinei reglează procesele metabolice la insecte. Nu am găsit niciun efect al căii hormonului adipokinetic asupra acestei modulații. În schimb, calea insulinei a fost implicată în aceste modificări. Muștele lipsit de receptorul de insulină (InR) nu a răspuns la privarea de nutrienți prin creșterea consumului de drojdie. Împreună, aceste rezultate arată importanța insulinei în reglarea consumului de drojdie ca răspuns la foamete la bărbații adulți D. melanogaster.

Introducere

Mecanismele care controlează aportul de alimente și homeostazia energetică sunt destul de bine conservate la speciile animale, cu o bună omologie între vertebrate și nevertebrate. După o masă bogată în substanțe nutritive, aportul de calorii este detectat și induce un feedback care declanșează sațietatea și suprimă consumul de alimente prin căi hormonale. La insecte, calea peptidei de tip insulină/hormon adipokinetic (ILP/AKH), ​​omologă cu calea insulină/glucagon a mamiferelor, joacă un rol central în reglarea hranei (Lee și Park, 2004; Bharucha și colab., 2008; Root și colab. al. al., 2011).

În Drosophila melanogaster, consumul de alimente promovează eliberarea Unpaired 2 (Upd2) din corpul gras, o proteină considerată omologă cu leptina mamiferelor (Rajan și Perrimon, 2012). Upd2 stimulează eliberarea ILP-urilor (Rajan și Perrimon, 2012) care acționează asupra neuronilor olfactivi prin inhibarea căii neuropeptidice scurte F (sNPF, un omolog al neuropeptidei Y), rezultând o scădere a sensibilității la mirosurile alimentare (Root et. al., 2011). Spre deosebire de hrănire, foamea crește sensibilitatea fiziologică și induce aportul de alimente la insecte (Farhadian și colab., 2012; Farhan și colab., 2013). Creșterea hrănirii se datorează cel puțin parțial activității neuronilor dopaminergici din ganglionul subesofagian, centrul gustului primar (Inagaki și colab., 2012; Marella și colab., 2012). Eliberarea dopaminei acționează asupra neuronilor gustativi responsabili de sensibilitatea la zahăr, care exprimă și receptori AKH (Bharucha și colab., 2008).

Privarea alimentară și compoziția macronutrienților din dietă afectează atât fiziologia, cât și comportamentul în larvele D. melanogaster (Anagnostou și colab., 2010; Andersen și colab., 2010; Bjordal și colab., 2014) și adulți (Skorupa și colab., 2008; Becher și colab. al., 2010; Lushchak și colab., 2011; Lebreton și colab., 2012). Proteinele dietetice activează atât căile ILP, cât și căile AKH, în timp ce zaharurile dietetice activează calea ILP, dar inhibă calea AKH (Buch și colab., 2008). ILP și AKH nu sunt implicate doar în reglarea hrănirii, ci și în mai multe trăsături comportamentale și fiziologice dependente de foame/sațietate la adulți, cum ar fi mobilizarea și stocarea energiei, absorbția nutrienților în intestinul mediu, fecunditatea și reproducerea sau comportamentul sexual și Park, 2004; Bharucha și colab., 2008; Liu și colab., 2009; Wigby și colab., 2011; Kodrík și colab., 2012). Efectul unei diete bogate în proteine ​​asupra acestor căi hormonale este bine descris (Buch și colab., 2008). Drojdiile joacă un rol esențial în nutriția și ecologia mustei (Begon, 1982; Becher și colab., 2012) pentru care sunt o sursă esențială de proteine ​​(Skorupa și colab., 2008) și, de asemenea, lipide (Bos și colab., 1976 ).). În consecință, ne putem aștepta ca muștele hrănite cu o dietă lipsită de acești nutrienți să fie atrase de drojdii chiar dacă dieta lor anterioară a avut o valoare calorică ridicată.

În ciuda importanței ecologice a drojdiei, se știe puțin despre factorii fiziologici care reglementează comportamentul de hrănire a drojdiei la D. melanogaster adult. În acest studiu, am investigat dacă lipsa nutrienților esențiali într-o dietă ar afecta comportamentul ulterior de hrănire a drojdiei la bărbații D. melanogaster. Glucoza din dietă a fost suficientă pentru a modula apetitul și, prin urmare, am investigat mecanismele fiziologice și hormonale care stau la baza efectului zahărului din dietă asupra consumului suplimentar de drojdie, cu accent pe calea ILP/AKH.

Materiale și metode

Tulpini de zbor și creștere

glucoza

Prezentare generală a proiectului experimental. Asteriscurile indică când s-a măsurat consumul de alimente.

Cultura drojdiei

Saccharomyces cerevisiae (S288c) a fost crescut pe un mediu minim sintetic (Merico și colab., 2007), în baloane de 100 ml la 25 ° C pe un agitator rotativ timp de 21 ore. Suspensia celulară a fost împărțită în porțiuni și menținută la -80 ° C până la aplicarea în testul de alimentare.

Test de hrănire pentru consumul de drojdie

Consumul de drojdie a fost analizat cu o versiune modificată a testului CAFE (Ja și colab., 2007; Farhadian și colab., 2012). Masculii individuali au fost izolați și așezați într-o ceașcă de plastic de 30 ml. Paharul de plastic a fost plasat pe partea superioară a unei sticle de 250 ml sticlă umplută cu 20 ml apă distilată. Fundul cupei a fost străpuns pentru a oferi umiditate. Soluția de drojdie a fost furnizată din partea de sus într-un microcapilar de sticlă de 5 μL ținut de un vârf de pipetă tăiat. Consumul de drojdie a fost măsurat la fiecare oră în primele 7 ore și după 24 de ore (Figura (Figura 1). 1). Un experiment de control fără muște a fost efectuat în același timp pentru a măsura rata de evaporare a soluției de drojdie, care a fost utilizată pentru a corecta rata de consum în experimentele cu muște.

Pentru a verifica cantitatea de zahăr (glucoză, sucraloză) consumată de muște, același test a fost utilizat cu bărbați împerecheați înfometați în vârstă de 2 zile peste 24 de ore. Pentru fiecare test au fost folosite nouă până la unsprezece muște (Figura (Figura 1.1).

analize statistice

Pentru a testa diferențele dintre diferite diete (apă, făină de porumb, glucoză, sucraloză) la hrănirea cu drojdie peste 24 de ore, a fost efectuat un test de comparație multiplă (funcția glht, pachetul multcomp) pe modelul de efecte mixte cu indivizi și timpul ca aleatoriu efecte (funcția lme, pachetul nlme). Efectele factorilor au fost analizate cu un test F. Efectul AKHR și InR asupra consumului de drojdie a fost, de asemenea, analizat folosind un model de efecte mixte. Mortalitatea muștelor InR a fost testată folosind un GLM cu distribuție binomială (efectul dietei și genotipului). Un test de χ 2 a fost folosit pentru a compara muștele mutante și pentru a controla muștele pentru fiecare dietă. Analizele statistice au fost calculate folosind R (R 2.1.1, R Development Core Team, Free Software Foundation Boston, MA, SUA).

Rezultate

Glucoza alimentară modulează comportamentul de hrănire cu drojdie

Modularea consumului de drojdie. (A) Efectul dietei de glucoză, sucraloză, apă și făină de porumb asupra hrănirii ulterioare a drojdiei în Drosophila timp de 24 de ore. (B) Consumul de glucoză și sucraloză de către muștele înfometate în vârstă de 2 d. Toate datele sunt medii ± SEM.

Calea insulinei influențează consumul de drojdie

Am studiat apoi dacă calea insulină/AKH este implicată în efectul glucozei asupra comportamentului alimentar suplimentar. Lipsa receptorului AKH la muștele Akhr Null nu a avut niciun efect asupra consumului de drojdie în comparație cu muștele martor (Akhr Rev) (F = 0,029, df = 1, p = 0,87), indiferent de dietă (glucoză sau sucraloză) (Figura (Figura 3A; 3A; dieta de interacțiune * genotip: F ​​= 0,00006, df = 1, p = 0,99).

Reglarea hormonală a comportamentului de hrănire a drojdiei. (A) Rolul AKH și (B) calea insulinei la consumul de drojdie, ca răspuns la zaharurile din dietă. Toate datele sunt medii ± SEM.

În schimb, o mutație a comportamentului de hrănire a afectat InR în funcție de dieta anterioară cu mușchiul (Figura (Figura 3B; 3B; dieta de interacțiune * genotip: F ​​= 7.04, df = 1, p = 0.012). Într-adevăr, mutanții InR nu au răspuns la privarea de nutrienți (dieta sucralozei) prin creșterea ratei consumului de drojdie (Figura (Figura 3B). 3B). Aceste muște au prezentat, de asemenea, un consum mai mare de drojdie atunci când sunt hrănite cu glucoză, cel puțin în primele câteva ore ale testului (Figura (Figura 3B)) . 3B). Mai mult, mutanții insulinei au fost mai rezistenți la înfometare (Figura (Figura 4). 4). Când au fost hrăniți cu sucraloză timp de 2 zile, 8,3% (1 din 12) din muștele mutante InR au murit în timpul perioadei de testare, comparativ cu 61,5% (16 din 26) de muște de control Când au fost hrănite cu glucoză, toate muștele au supraviețuit în această perioadă (Figura 4; 4; efect de dietă: Dev. = 17,91, df = 1, p 2 = 10,81, df = 1, p = 0,001), dar cele care au supraviețuit au prezentat o rată de consum de drojdie similară (0,53 ± 0,16 μL după 24 de ore pentru muștele WT (n = 6); 0,46 ± 0,17 μL pentru muștele de control InR (n = 10); W = 29, p = 0,86).

Mortalitatea mutantului InR și a muștelor de control în timpul experimentului de hrănire atunci când au fost hrăniți anterior cu glucoză sau cu sucraloză timp de 1 sau 2 zile. Asteriscurile arată o diferență de mortalitate între cele două grupuri de muște (Chi 2 -test, χ = 7,37, df = 1, p = 0,007).

Discuţie

Ecologia drojdiilor și a muștelor Drosophila este puternic interconectată. Mai multe specii de Drosophila hrănesc pe drojdii care cresc pe suprafața fructelor în descompunere în timpul vieții lor larvare și adultă. Privarea levurilor în timpul dezvoltării larvelor determină o creștere drastică a mortalității (Anagnostou și colab., 2010; Becher și colab., 2012). Compușii volatili produși de drojdii atrag puternic muștele Drosophila către fermentarea fructelor care constituie un substrat de hrănire, împerechere și ouă (Becher și colab., 2012). Reciproc, atunci când călătoresc de la fruct la fruct, muștele servesc drept vector pentru a răspândi drojdiile (Spencer și Spencer, 1997; Becher și colab., 2012).

Drojdiile sunt o sursă majoră de proteine ​​și lipide pentru muștele Drosophila (Bos și colab., 1976; Skorupa și colab., 2008). Dietele dezechilibrate, care conțin în principal zaharuri, duc la muște obeze, de scurtă durată (Skorupa și colab., 2008). Adăugarea de drojdie la dietele dezechilibrate contracarează efectul negativ al zahărului (Skorupa și colab., 2008). Prin urmare, ne așteptam ca masculii hrăniți numai cu glucoză să se hrănească cu drojdie. Cu toate acestea, aceste muște nu au crescut consumul de drojdie în comparație cu muștele hrănite cu mediu bogat în făină de porumb care conține drojdie. În consecință, glucoza alimentară a fost suficientă pentru a reduce ulterior hrănirea cu drojdie. Drojdia are un rol esențial în fecunditatea feminină, deoarece stimulează producția de ouă (Skorupa și colab., 2008). Chiar dacă nutriția afectează și producția de descendenți masculi și abilitățile competitive (Fricke și colab., 2008), privarea de drojdie ar putea să nu fie la fel de critică pentru bărbați ca și pentru femele. Într-adevăr, chiar și când sunt înfometați timp de 3 zile, masculii Drosophila sunt capabili să se împerecheze și să producă la fel de mulți descendenți ca și masculii hrăniți în condiții necompetitive (Lebreton și colab., 2014). În consecință, o perioadă de 3 zile de privare a drojdiei ar putea avea doar un efect mic asupra fitnessului masculin. Acest lucru ar explica de ce bărbații hrăniți doar cu glucoză nu cresc consumul de drojdie în experimentele noastre.

Folosind sucraloză, un îndulcitor nemetabolizabil (Gordesky-Gold și colab., 2008), am arătat că efectul zahărului nu se datorează unui feedback mecanic al hrănirii sau gustului dulce al glucozei, ci mai degrabă datorat fie caloricului său sau la utilizarea glucozei ca moleculă semnal. Muștele Drosophila sunt capabile să detecteze conținutul caloric al zaharurilor printr-un proces independent de gust (Dus și colab., 2011) și, prin urmare, învață să discrimineze zaharurile cu diferite valori nutritive (Burke și Waddell, 2011; Stafford și colab., 2012 ). Un senzor de nutrienți din creierul mustei detectează direct o creștere a nivelului de zahăr hemolimfă cu efect diferențial la muștele înfometate și sățioase (Miyamoto și colab., 2012). S-a emis ipoteza că căile hormonale, cum ar fi semnalizarea insulinei, ar putea provoca acest efect (Miyamoto și colab., 2012).

Calea insulinei modulează preferința alimentară în larvele Drosophila (Wu și colab., 2005a, b; Zhao și Campos, 2012). Rezultatele noastre arată că calea insulinei influențează și comportamentul de hrănire a drojdiei la adulți. Un efect opus al insulinei a fost observat în funcție de compoziția dietei, sugerând că insulina ar putea regla consumul de drojdie ca răspuns atât la aportul de nutrienți (alimentat cu glucoză), cât și la privare (muște alimentate cu sucraloză). S-a raportat anterior că o mutație nulă a mușchiului substrat InR chico nu afectează consumul de alimente Drosophila (Wong și colab., 2009). Este posibil ca calea insulinei să regleze în principal consumul de alimente ca răspuns la schimbările în disponibilitatea nutrienților, mai degrabă decât să modifice aportul de alimente ca atare.

Când au fost hrăniți cu glucoză, muștele mutante InR nu au suprimat consumul de drojdie în primele câteva ore, sugerând că calea de semnalizare a insulinei poate juca un rol în reglarea comportamentului de hrănire, de asemenea, ca răspuns la aportul de nutrienți. Eșecul de a ajusta aportul de alimente ca răspuns la disponibilitatea alimentelor a fost observat anterior la muștele mutante care au fost luate (Meunier și colab., 2007). Gena de eliminare codifică o proteină de legare a hormonului juvenil putativ (JH) și este implicată în comportamentul de hrănire și în metabolism. Asemănător cu mutanții InR din experimentele noastre, mutanții la consum nu își măresc consumul de alimente după o perioadă de foame, ci continuă să se hrănească atunci când alimentele sunt abundente (Meunier și colab., 2007). Legătura dintre insulină și administrare nu este clară, dar expresia atât a ilp3 cât și a administrării este reglementată de același canal de potasiu sensibil la calciu și la tensiune (SLOB). Muștele mutante SLOB au niveluri scăzute de ilp3 și niveluri crescute de preluare (Sheldon și colab., 2011). Mai mult decât atât, un studiu recent efectuat pe gândacul de făină roșie, Tribolium castaneum, a sugerat că JH reglează rezistența la foamete prin reglarea sintezei ILP2 (Xu și colab., 2013).

Interesant este faptul că mutanții care au luat la consum au o rezistență scăzută la înfometare (Sarov-Blat și colab., 2000). Spre deosebire de preluare, raportăm că mutanții InR au o rezistență crescută la foamete, confirmând constatările anterioare (Broughton și colab., 2005). Deoarece mutanții InR nu cresc consumul de alimente ca răspuns la foamete, este posibil să nu crească activitatea locomotorie, care este asociată cu hrănirea alimentelor la muștele WT (Lee și Park, 2004). Creșterea activității locomotorii induce o epuizare mai rapidă a rezervelor de energie și crește mortalitatea. Creșterea rezistenței la foame a fost observată și la muștele cu o cale alterată a AKH (Lee și Park, 2004; Bharucha și colab., 2008).

Atât preluarea, cât și Akhr sunt exprimate în neuroni gustativi care detectează zaharuri (Meunier și colab., 2007; Bharucha și colab., 2008). În timp ce eliminarea crește sensibilitatea acestor neuroni după o perioadă de foame (Meunier și colab., 2007), efectul Akhr este necunoscut. Nu am găsit niciun efect al AKHR asupra reglării consumului de drojdie la muștele adulte. Rezultatele noastre sugerează că rolul AKH ca răspuns la foamete ar putea fi limitat în principal la reglarea metabolismului zahărului și a lipidelor (mobilizare și depozitare), mai degrabă decât la reglarea comportamentului de hrănire. Acest lucru este în contrast cu constatările lui Bharucha și colab. (2008) care au raportat că mutanții AKHR au un aport redus de alimente după o perioadă de foame. O posibilă explicație a discrepanței dintre cele două studii este că Bharucha și colegii săi s-au concentrat asupra primelor 30 de minute după înfometare, în timp ce raportăm aici consumul de alimente la 1-24 de ore după înfometare. Prin urmare, este posibil ca mutanții AKHR să aibă o inițiere întârziată a hrănirii după foamete, consumul total de alimente pe perioade mai lungi nefiind afectat. Efectul AKH asupra reglării comportamentului alimentar rămâne neclar și vor fi necesare studii suplimentare pentru a dezlega rolul precis al AKH asupra consumului de alimente.

În rezumat, studiul de față aduce noi informații despre modul în care este modulat consumul de drojdie, o sursă de nutrienți relevantă din punct de vedere ecologic. Deși glucoza alimentară este incompletă în ceea ce privește conținutul de substanțe nutritive esențiale, pare să fie suficient pentru a reduce consumul de drojdie la bărbații adulți. Sa constatat că insulina este implicată în reglarea hrănirii cu drojdie, în timp ce nu a fost detectat niciun efect al AKH. Aceste rezultate abordează problema rolului precis al insulinei și căii AKH în reglarea interacțiunilor Drosophila-drojdie.

Declarație privind conflictul de interese

Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricărei relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretată ca un potențial conflict de interese.

Mulțumiri

Îi mulțumim lui Richard Hopkins pentru că a oferit comentarii utile asupra manuscrisului și a corectat limba engleză. Acest studiu a fost susținut de Universitatea Agricolă Suedeză (Marie Olsson și Peter Witzgall - grant KoN) și Consiliul Suedez de Cercetare Formas (Paul G. Becher - grant pentru tineri cercetători).