1 Universitatea de Medicină Tradițională Chineză Shandong, Jinan 250000, China

tiaozhi

2 Departamentul de Neurologie, Spitalul Afiliat al Universității de Medicină Tradițională Chineză Shandong, Jinan 250011, China

Abstract

1. Introducere

Hipercolesterolemia, o boală anormală a metabolismului lipidic, este principalul factor de risc în generarea și dezvoltarea bolilor coronariene (CHD) [1, 2]. În special, concentrația ridicată de colesterol lipoproteic cu densitate redusă (LDL-C) circulantă este adesea asociată cu apariția infarctului miocardic [3]. Conform studiilor recente, boala coronariană ca epidemie globală de boli netransmisibile este principala cauză de deces [4], iar rata mortalității bolii cardiovasculare în China a crescut de la 16% la 24% în zece ani [5, 6]. În plus, hipercolesterolemia este, de asemenea, legată de berze [7], de boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) [8] și de supraponderalitatea [9].

Sursele de colesterol la mamifere sunt biosinteza de novo din acetil-CoA, endocitoza mediată de receptorul LDL (LDLR) din plasmă și absorbția din dietă, în care 70% până la 80% din colesterol este sintetizat de ficat in vivo [10]. 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductaza (HMGCR) ca enzimă care limitează rata, precum și ținta de reglare a feedback-ului catalizează HMG-CoA în mevalonat, care este pasul cheie al sintezei colesterolului. Mai mult, transcrierea genei HMGCR este reglementată de proteina 2 care leagă elementul de reglare a sterolului (SREBP-2), care este un factor principal de transcripție nucleară [11]. Conform ghidurilor clinice, statinele care vizează reducerea sintezei colesterolului sunt recomandate ca tratament de primă linie la pacienții cu CHD cauzată de creșterea colesterolului, în special a nivelurilor LDL-C [12, 13]. Cu toate acestea, chiar și terapia cu statine de intensitate moderată sau ridicată face, de asemenea, 20% dintre pacienți obiectivul tratamentului LDL-C de atingere a -1 [14]. Și costurile terapiei și efectele secundare nu pot fi ignorate [15, 16]. Prin urmare, este urgent să se concentreze hotspot-ul de cercetare pe căutarea unor medicamente noi, sigure și eficiente care scad colesterolul.

Medicina tradițională chineză (TCM) cu multitarget și multipathway are un avantaj pentru tratarea cursurilor complexe de boli [17, 18]. Granula Shuangyu Tiaozhi (STG) compusă din Shuyu și Bixie derivă din decoctul Huazhuo Xingxue care a fost utilizat pentru scăderea nivelului lipidelor în clinică. Studiile noastre anterioare au arătat că STG poate reduce nivelul lipidelor serice la pacienții cu hipercolesterolemie [19]. În prezentul studiu, ne propunem să investigăm dacă efectul diferitelor doze și timpii de tratament ai STG, o rețetă tradițională chineză, asupra greutății corporale, a lipidelor serice și a nivelului colesterolului hepatic este prin reglarea căii de sinteză a colesterolului și a absorbției colesterolului mediată de LDLR dietă cu colesterol ridicat (HC) alimentată cu șobolani.

2. Materiale și metode

2.1. Animale

Cincizeci de șobolani masculi Sprague Dawley (SD), în vârstă de 6 săptămâni, cu o greutate cuprinsă între 160 g și 180 g au fost achiziționați de la Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Beijing, China). Șobolanii au fost adăpostiți într-un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore la o temperatură controlată (23 ± 2 ° C) într-un mediu de umiditate de 50-60%. Și tuturor șobolanilor li s-a permis accesul gratuit pentru a achiziționa energie și apă potabilă. Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și aprobat de Comitetul de etică al Universității de Medicină Tradițională Chineză din Shandong.

2.2. Pregătirea STG

Componentele STG includ 60 g de Shuyu (Rhizoma Dioscoreae) și 18 g de Bixie (Dioscoreae Spongiosae Rhizoma). Iar granulele concentrate pe bază de plante (1 g granule concentrate = 20 g bucăți din plante chinezești) au fost furnizate de Jiangyin Tian Jiang Pharmaceutical Co., Ltd. (Jiangsu, China), și au fost identificate de Prof. Feng Li de la Colegiul de Farmacie, Universitatea de Medicină Tradițională Chineză din Shandong. Pentru in vivo studii, STG a fost livrat la Beijing Keaoxieli Feed Co., Ltd. (Beijing, China) pentru a adăuga 5% (g/g) sau 10% (g/g) STG la dieta HC (Tabelul 1).

2.3. Inducerea hipercolesterolemiei și tratamentul medicamentos

După adaptarea la mediu timp de 1 săptămână, toți șobolanii au fost hrăniți cu dietă generală sau dietă HC (Beijing Keaoxieli Feed Co., Ltd., Beijing, China) timp de 4 săptămâni. În multe studii anterioare, nivelul lipidelor serice al tuturor șobolanilor a crescut după ce a fost hrănit cu dietă HC timp de 4 săptămâni [20]. Toți șobolanii experimentali au fost împărțiți în mod aleatoriu în 5 grupuri (n = 10 per grup): grup de dietă generală (control), grup de dietă HC (HC), dietă HC suplimentată cu grup STG cu doză mare (10% (g/g) STG, HSTG), dieta HC suplimentată cu grupul STG cu doză mică (5% (g/g) STG, LSTG) și dieta HC suplimentată cu grupul simvastatină (simvastatină). În special, grupul de simvastatină a fost administrat prin intragastric de simvastatină (dizolvat în soluție salină la o doză de 4 mg · kg -1 -1 d -1, Hangzhou Moshadong Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, China). Greutatea corporală a șobolanilor a fost măsurată regulat la fiecare două săptămâni și doza de simvastatină a fost ajustată în funcție de greutatea șobolanilor. După ce au fost tratați cu STG sau simvastatină timp de 4 sau 8 săptămâni, șobolanii au fost sacrificați pentru a colecta probe de sânge și ficat. O parte din țesutul hepatic a fost fixată în paraformaldehidă 4% pentru colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) și imunohistochimie, iar partea rămasă a fost congelată în azot lichid și apoi depozitată la -80 ° C până la o analiză ulterioară.

2.4. Analiza serului

Probele de sânge au fost colectate din aorta abdominală. După plasarea timp de 1 oră la temperatura camerei, probele de sânge au fost centrifugate la 1500 × g timp de 10 minute pentru a obține supernatantul. Probele de ser au fost depozitate la -20 ˚ C și colesterolul total (TC), trigliceridele (TG), lipoproteinele cu densitate scăzută-colesterol (LDL-C) și nivelurile de lipoproteină-colesterol cu ​​densitate ridicată (HDL-C) au fost măsurate printr-un sistem biochimic automat analizor în laboratorul clinic al Spitalului Afiliat al Universității de Medicină Tradițională Chineză Shandong (Jinan, China).

2.5. Analiza lipidelor hepatice

Lipidele hepatice au fost măsurate folosind un kit de testare a colesterolului total tisular sau un kit de testare a colesterolului fără țesuturi (E1015, E1016, Applygen Technologies Co., Ltd, Beijing, China) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Nivelurile de colesterol din ficat au fost corectate de concentrațiile de proteine.

2.6. Colorarea H&E

Țesuturile hepatice au fost încorporate în parafină și disecate în 5 μm secțiuni groase. Apoi secțiunile colorate H&E au fost observate la microscopie cu lumină (Olympus BX51, Japonia).

2.7. PCR în timp real

ARN-ul total a fost extras din țesuturile hepatice de șobolan cu reactiv Trizol (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, SUA) urmând instrucțiunile producătorului. Concentrațiile de ARN au fost analizate spectrofotometric (Nanodrop 2000c, Thermo Fisher Scientific, SUA). Conform instrucțiunilor producătorului, transcrierea inversă a fost efectuată cu un kit 5x All-In-One RT MasterMix (Abm, Canada), iar PCR în timp real a fost efectuată folosind un kit SYBR Green PCR Master Mix (DBI Bioscience, Germania) în LC480 (Roche, Mannheim, Germania). Toate cuantificările au fost efectuate folosind GAPDH ca control endogen. Datele au fost analizate folosind 2

metodă. Fiecare probă a fost testată în mod repetat de trei ori. Secvențele de exemplu au fost enumerate în Tabelul 2.

2.8. Pregătirea proteinelor și Western Blot
2.9. Imunohistochimie

Imunohistochimia a fost efectuată folosind un kit universal de detectare în doi pași (PV9000, Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Beijing, China) pentru a detecta expresia proteinei SREBP-2 în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pe scurt, secțiunile hepatice au fost depilate, recuperate antigen recuperat și incubate cu blocant de peroxid endogen timp de 10 minute la temperatura camerei și apoi incubate cu anticorpul primar (1: 100, abcam, Burlingame, CA, SUA, ab28482) peste noapte la 4 ( C. Expresia proteinei a fost observată prin microscopie cu scanare laser (Zeiss Vert.A1, Carl Zeiss Canada).

2.10. Analize statistice

Datele au fost reprezentate ca medie ± deviație standard (SD). Pentru a compara diferențele statistice cu mai multe grupuri, a fost utilizată analiza ANOVA unidirecțională urmată de diferența cea mai puțin semnificativă a lui Fisher (LSD) sau testul Dunnett. Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul SPSS 23.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, SUA). P
(A)
(b)
(c)

P P
(A)
(b)
(c)

P > 0,05 versus grupul HSTG. Toate datele au fost prezentate ca medie ± SD.

LDLR joacă un rol crucial în menținerea homeostaziei colesterolului, iar absorbția LDL-C mediată de LDLR este cel mai important mod de a elimina colesterolul seric din organism [39]. LDLr

șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi prezintă un nivel ridicat de colesterol în ser și ficat și astfel au fost folosiți pentru a dezvolta modelul de ateroscleroză și ficat gras [40-42]. Am examinat ARNm de LDLR în ficat, iar rezultatele au sugerat că STG poate crește semnificativ nivelurile de ARNm LDLR. În plus față de reglarea descendentă a genelor de sinteză a colesterolului, acest studiu a arătat, de asemenea, că STG a scăzut expresia ACAT-2 mARN și apoi a redus esterificarea colesterolului. ACAT-2 hepatic este implicat în lipoproteinele care conțin apoB (VLDL, LDL), ambalarea colesterolului și ștergerea ACAT-2 hepatică a dus la o reducere a colesterolului VLDL [43]. Majoritatea VLDL s-au transformat în LDL după ce au intrat în sânge. Aici am arătat că STG a scăzut expresia mARN-ului ACAT-2 hepatic, contribuind astfel la reducerea nivelului seric al LDL-C.

În TCM, deficiența splinei și abundența umedă sunt adesea responsabile de dislipidemie. Amânându-se de la Dio, o componentă activă principală izolată din ierburile dioscorea [44, 45], tratamentul STG reduce colesterolul seric și hepatic din multiple ținte și niveluri multiple, cu o combinație de shuyu și bixie. În concluzie, rezultatele prezentului studiu au demonstrat că STG atenuează hipercolesterolemia și reduce acumularea hepatică de colesterol la șobolanii hrăniți cu o dietă HC. Acțiunile de scădere a colesterolului ale STG au fost gene de sinteză a colesterolului reglate în jos și au crescut clearance-ul plasmei LDL-C. Aceste rezultate au indicat faptul că STG este un tratament eficient pentru scăderea nivelului de colesterol și, astfel, încetinirea apariției și dezvoltării CHD. Cercetările noastre au relevat doar suplimentarea cu STG, nivelurile mai scăzute de colesterol fiind dependente de timp și doză în două concentrații. Și studii suplimentare privind includerea setării gradientului de concentrație a STG și adăugarea părților clinice pot fi utile pentru a explora relația doză-efect a STG în atenuarea hipercolesterolemiei.

Disponibilitatea datelor

Toate datele utilizate sau analizate ale acestui studiu sunt disponibile la cerere prin contactul cu autorul relevant.

Conflicte de interes

Autorii declară că nu există conflicte de interese.

Contribuțiile autorilor

Fengxia Zhang și Jingjing Shi au conceput experimentele; Fengxia Zhang a făcut o prezentare generală a studiului și a oferit îndrumări tehnice; Jingjing Shi și Ruoqi Li au efectuat experimentele; Haifei Lu și Lu Yu au efectuat o parte din experimente; Yi Liu a contribuit cu instrumente de analiză; Jingjing Shi și Ruoqi Li au analizat datele; Jingjing Shi a scris manuscrisul. Toți autorii au examinat manuscrisul.

Mulțumiri

Autorii doresc să își exprime recunoștința profesorilor din Laboratorul Central al Universității de Medicină Tradițională Chineză din Shandong. Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională de Științe Naturale din China (nr. 81573945) și de Proiectul de dezvoltare științifică și tehnologică din provincia Shandong (nr. 2013GSF11902).

Referințe