Abstract

fundal

Fumatul are consecințe adverse grave asupra sănătății la adulți și la descendenții mamelor care fumează în timpul sarcinii. Unul dintre cele mai raportate efecte ale fumatului în timpul sarcinii este greutatea redusă la naștere, care este la rândul ei asociată cu boli cronice la vârsta adultă. Studiile de asociere la nivel de epigenom au arătat că fumătorii prezintă un tipar caracteristic de „metilare a fumatului”, iar autorii recenți au sugerat că metilarea ADN mediază impactul fumatului matern asupra greutății la naștere. Scopul prezentului studiu a fost de a reproduce rapoartele anterioare că metilarea mediază efectul fumatului matern asupra greutății la naștere și, pentru prima dată, să investigheze dacă efectele de mediere observate sunt specifice sexului pentru a ține cont de diferențele cunoscute de nivelurile de metilare.

asupra

Metode

Nivelurile de metilare în sângele din cordonul ombilical al a 313 nou-născuți au fost determinate folosind Illumina HumanMethylation450K Beadchip. Au fost testate un total de 5.527 site-uri CpG selectate pe baza dovezilor din literatura de specialitate. Pentru a determina dacă asocierea observată între fumatul matern și greutatea la naștere a fost atribuită metilării, s-au efectuat analize de mediere pentru siturile CpG semnificative. Au fost apoi efectuate analize separate la bărbați și femei.

Rezultate

În urma controlului calității, 282 de nou-născuți au rămas în cele din urmă în analiză. Un total de 25 de mame au fumat constant pe tot parcursul sarcinii. Greutatea la naștere a nou-născuților ale căror mame fumaseră pe tot parcursul sarcinii a fost redusă cu> 200g. După corecție pentru teste multiple, 30 CpG au arătat metilare diferențială în subgrupul de fumat matern, inclusiv genele de top „tipar de metilare a fumatului” AHRR, MYO1G, GFI1, CYP1A1, și CNTNAP2. Efectul fumatului matern asupra greutății la naștere a fost parțial mediat de metilarea cg25325512 (PIM1); cg25949550 (CNTNAP2); și cg08699196 (ITGB7). Analizele specifice sexului au relevat un efect de mediere pentru cg25949550 (CNTNAP2) la nou-născuții de sex masculin.

Concluzie

Datele actuale replică constatările anterioare că metilarea poate media efectul fumatului matern asupra greutății la naștere. Analiza efectelor de mediere dependente de sex sugerează că sexul nou-născutului poate avea o influență. Studiile mai mari sunt justificate pentru a investiga rolul atât al locurilor identificate diferit metilate, cât și al sexului nou-născutului în medierea asocierii dintre fumatul matern în timpul sarcinii și greutatea la naștere.

fundal

Un mecanism plauzibil prin care expunerea la afecțiuni intrauterine adverse poate avea un impact negativ asupra sănătății pe termen lung este metilarea ADN-ului. Investigațiile CpG candidate și studiile de asociere la nivel epigenom (EWAS) au găsit asociații consistente între fumat și metilarea diferențială a ADN la adulți [16,17,18]. O serie de studii au investigat, de asemenea, impactul fumatului matern în timpul sarcinii asupra modelelor de metilare la descendenți. Aceste investigații au cuprins abordări generale ale genei și genomului [19,20,21,22,23], precum și EWAS [24,25,26,27,28,29,30,31]. În aceste EWAS, o serie de gene metilate diferențial au arătat o asociere repetată și consecventă [32,33,34]. Primele cinci gene sunt AHRR, GFI1, MYO1G, CYP1A1, și CNTNAP2.

Autorii anteriori au formulat ipoteza că fumatul matern afectează greutatea la naștere prin metilarea ADN-ului indusă de fumat. Conform acestei teorii, metilarea diferențială funcționează ca un mediator, adică o variabilă care reprezintă o parte a relației dintre predictor și criteriu [35, 36]. Au fost deja efectuate analize inițiale pentru a determina dacă metilarea ADN mediază între fumatul matern și greutatea la naștere. În aceste investigații, s-a găsit un efect de mediere pentru opt CpGs într-o analiză a sângelui din cordonul infantil [37] și două CpGs într-o analiză a placentei [38].

Obiectivele prezentului studiu au fost de a reproduce efectele mediator raportate anterior ale metilării asupra asocierii dintre fumatul matern și greutatea la naștere și, pentru prima dată, să investigheze dacă efectele de mediere observate sunt specifice sexului. Analizele s-au concentrat pe site-urile legate de fumat de mare încredere și au fost limitate la site-urile CpG cu: (i) asociere semnificativă cu fumatul într-o meta-analiză recentă mare [31]; sau (ii) un efect mediator raportat în asocierea dintre fumatul matern și greutatea la naștere [37, 38].

Au fost efectuate și analize pentru a determina dacă efectele de mediere observate au fost specifice sexului, deoarece: (i) nivelurile de metilare prezintă diferențe substanțiale de sex [39]; (ii) diferențele de sex observate sunt prezente de la naștere [40] și (iii) diferite modele de metilare ar putea avea rezultate diferite.

Metode

Exemplu de descriere

Datele pentru prezentul studiu au fost derivate din studiul POSEIDON („Stresul pre-, peri- și postnatal la descendenții umani și non-umani: o abordare translațională pentru studierea impactului epigenetic asupra DepressiON”). O descriere detaliată a studiului POSEIDON este furnizată în altă parte [41]. Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al Facultății de Medicină Mannheim a Universității din Heidelberg, iar studiul a fost realizat în conformitate cu Declarația de la Helsinki. Au fost analizate datele de la 410 mame și 405 sugari recrutați în timpul celui de-al treilea trimestru de sarcină din spitale din regiunea Rin-Neckar din Germania. Pe scurt, criteriile de excludere maternă pentru prezentele analize au fost: (i) antecedente de hepatită B, hepatită C sau infecție cu HIV; (ii) orice diagnostic actual sau anterior de schizofrenie sau orice altă dependență de substanță decât nicotina; și (iii) orice tulburare psihiatrică actuală care necesită tratament internat. Criteriile de excludere la descendenți au fost: greutatea la naștere 0,01) la mai mult de 1% din poziții) au fost excluse. Probele au fost excluse dacă s-a îndeplinit oricare dintre următoarele criterii: număr de mărgele

Rezultate

După QC tehnic, un total de 405.654 de site-uri și 311 de persoane au fost, în principiu, disponibile pentru analiză. Un total de n = 5.527 dintre aceste site-uri CpG au fost raportate anterior asociate cu fumatul (a se vedea mai sus) și, prin urmare, au fost selectate pentru testarea asocierii. După excluderea nou-născuților născuți prematur și a persoanelor care au primit tratament antidiabetic în timpul sarcinii, dimensiunea eșantionului final a fost n = 282 persoane (138 bărbați și 144 femei). Dintre aceștia, 13 bărbați și 12 femele au fost descendenții mamelor care au fumat pe tot parcursul sarcinii. Caracteristicile generale ale participanților incluși în prezentul studiu sunt furnizate în fișierul suplimentar 1: Tabelul S1.

Impactul fumatului matern asupra greutății la naștere

Diferența medie în greutatea la naștere între grupurile de fumători și nefumători a fost de 209 g. Nou-născuții fumătorilor au avut o greutate medie la naștere de 3.267g. Nou-născuții nefumătorilor au avut o greutate medie de 3.476 g (vezi Tabelul 1; vezi și fișa suplimentară 1: Figura S2 pentru o comparație mai fină între diferite grupuri).

La nou-născuții (n= 144), greutatea medie la naștere a fost cu 189 g mai mică în subgrupul de fumători comparativ cu subgrupul de nefumători, adică greutatea la naștere a fost cu 5,6% mai mică atunci când mamele au fumat. Cu toate acestea, această diferență nu a atins semnificația statistică. La nou-născuții masculini (n= 138), greutatea medie la naștere a fost semnificativ mai mică cu 242g în subgrupul de fumători comparativ cu subgrupul de nefumători, adică greutatea la naștere a fost cu 6,7% mai mică atunci când mamele au fumat (vezi Tabelul 1).

Analiza asocierii de metilare

În urma corecției pentru teste multiple, un total de 30 de situri CpG au prezentat metilare diferențială semnificativă în subgrupul de fumat (vezi Tabelul 2). Aceste CpG sunt mapate la 13 gene (AHRR, CNTNAP2, CYP1A1, FRMD4A, GFI1, ITGB7, MIR548F3, MYO1G, PIM1, RNF157, SAMD3, TFEB, UNC45B).

EWAS privind fumatul nu a dezvăluit alte site-uri CpG asociate la nivelul întregului epigenom (datele nu sunt prezentate.

Nu a existat nicio asociere semnificativă între metoda de extracție a ADN-ului și nivelurile de metilare utilizând o abordare de modelare liniară, precum și includerea metodelor de extracție ca o covariabilă (datele nu sunt prezentate).

Analiza medierii

Dintre cele 30 de site-uri CpG găsite diferențial metilate după fumatul matern în eșantionul nostru, s-a constatat că cele care urmează mediază efectul fumatului matern asupra greutății la naștere: cg25325512 (PIM1, p = 0,005); cg25949550 (CNTNAP2, p = 0,008); și cg08699196 (ITGB7, p = 0,045). Analizele specifice sexului pentru aceste trei site-uri CpG au arătat că cg25949550 (CNTNAP2, p = 0,022) a mediat efectul fumatului matern asupra greutății la naștere la nou-născuții de sex masculin (vezi Tabelul 3).

Analiza genică a rezultatelor GWAS ale consorțiului EGG

În analiza bazată pe gene, PIM1, CNTNAP2, și ITGB7 au fost testate pentru asocierea cu greutatea la naștere. ITGB7 a arătat o asociere semnificativă (p= 8,24x10 -7). PIM1 și CNTNAP2 nu a reușit să atingă semnificația nominală (p> 0,05). Valorile p ale unui singur marker ale SNP la ITGB7 locus sunt listate în fișierul suplimentar 1: Tabelul S2.

Discuţie

Scopurile prezentului studiu au fost de a replica constatarea că asocierea dintre fumatul matern și greutatea la naștere este mediată de metilare și de a investiga dacă efectele de mediere observate sunt specifice sexului. Siturile CpG metilate diferențial au fost detectate la 13 gene, inclusiv AHRR, GFI1, MYO1G, CYP1A1, și CNTNAP2. Acestea reprezintă primele cinci gene metilate diferențial raportate la fumătorii adulți [16,17,18, 60, 61] și în studiile anterioare asupra nou-născuților expuși fumatului matern [25,26,27, 31, 32, 37].

Genele PIM1, CNTNAP2, și ITGB7 nu au fost implicați în EWAS anterioare ale greutății la naștere [69,70,71]. Cu toate acestea, într-o analiză bazată pe gene a datelor genetice obținute dintr-o analiză a asocierii la nivelul genomului a greutății la naștere de către Consorțiul EGG [58], autorii prezenți au constatat că ITGB7 a fost puternic asociat cu greutatea la naștere (p = 4, 2x10 -7). În plus, ITGB7 s-a constatat că este asociat cu fiziopatologia obezității infantile la o populație hispanică [72].

Deoarece nivelurile de metilare sunt cunoscute ca fiind specifice sexului deja la naștere, studiul de față a implicat analize de mediere specifice sexului. În mod surprinzător, acestea sugerează că efectele medierii pot fi, de asemenea, dependente de sex. Site-ul CpG din CNTNAP2 a avut un efect mai pronunțat la nou-născuții de sex masculin și nu a reușit să atingă semnificația la femei. Sunt posibile alte efecte de mediere specifice sexului. Cu toate acestea, detectarea lor va necesita probe mai mari.

Spre deosebire de studiile anterioare, înălțimea parentală a fost inclusă ca o covariabilă în prezentele analize, deoarece a avut o influență pronunțată asupra greutății la naștere în studiul nostru. Performanța analizei fără această covariabilă a obținut într-adevăr 45 de site-uri mai degrabă decât 30CpG asociate fumatului. În analiza de mediere a acestor 45 de site-uri CpG, alte trei site-uri au devenit semnificative în plus față de PIM1 și CNTNAP2 (vezi Fișierul suplimentar 1: Tabelul S3). Determinarea dacă constatările respective sunt adevărate sau false pozitive este problematică și poate fi rezolvată numai prin efectuarea unor studii mai mari și metaanalize.

Prezentul studiu a avut mai multe limitări în ceea ce privește fenotipul investigat asupra fumatului. Statutul de fumat a fost conceptualizat ca o trăsătură dihotomizată și nu s-a făcut nicio distincție între fumătorii ușori și cei mari. Mai mult, fumatul a fost evaluat folosind auto-rapoarte retrospective, mai degrabă decât măsuri prospective și obiective, cum ar fi nivelurile de cotinină. Acest lucru ar fi putut duce la o subestimare a numărului de mame fumătoare și, astfel, la o subestimare a efectului direct și la o supraestimare a efectului de mediere a fumatului. Acest fenomen a fost raportat recent de Valeri și colab. într-un studiu asupra cohortei norvegiene MoBa [73]. Cu toate acestea, auto-raportarea nesigură a stării de fumat în cohorta actuală este puțin probabilă din două motive. În primul rând, subiecții au avut o relație ridicată de încredere, deoarece au primit îngrijiri obstetricale regulate la centrele de recrutare pe tot parcursul sarcinii. În al doilea rând, efectul direct al fumatului asupra greutății la naștere în cohorta actuală (reducerea medie a greutății la naștere de

200g) a fost mai pronunțată decât cea raportată în studiul MoBa al lui Valeri și colab.

90g). Rata de auto-raportare falsă este probabil să fie în concordanță cu ratele raportate în studiile anterioare.

Concluzii

Prezentul studiu susține constatările raportate conform cărora metilarea ADN-ului poate reprezenta un mecanism biologic prin care fumatul matern afectează greutatea la naștere. În mod surprinzător, acest efect poate fi dependent de sex, așa cum sa sugerat pentru prima dată în prezentele analize. Studii suplimentare sunt justificate pentru a investiga rolul locurilor metilate diferențiat identificate în medierea asocierii dintre fumatul matern în timpul sarcinii și greutatea la naștere și rolul lor în determinarea fenotipilor descendenților în viața ulterioară.