• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

Editat de John E. Halver, Universitatea din Washington, Seattle, WA și aprobat la 20 octombrie 2008 (primit pentru examinare la 18 iulie 2008)

este

Abstract

Creșterea celulară eucariotă se bazează pe activarea complexelor de proteine ​​ciclină/kinază dependentă de ciclină (CDK) care funcționează în etape specifice ale ciclului celular (23). Multe tumori mamare prezintă niveluri ridicate de ciclină E și ciclină D, care implică pierderea controlului ciclului celular prin dereglarea fazei G1 a ciclului celular (24, 25). Ambele forme de ciclină cu greutate moleculară mare și cu greutate moleculară mai mică au fost detectate în celulele de mamifere. Interesant este faptul că multe țesuturi extrem de proliferative, cum ar fi cel al cancerului de sân metastatic, exprimă predominant formele de ciclină cu greutate moleculară mai mică (26-28), în timp ce țesutul normal corespunzător prezintă, în general, o formă de ciclină cu greutate moleculară mai mare ( 26).

Am raportat anterior că tratamentul I3C al celulelor cancerului mamar uman MCF-7 a cauzat formarea unui complex proteic inactiv, 200-kDa CDK2 în comparație cu un complex proteic activ, 90-kDa CDK2 observat în celulele în creștere netratate (29). În absența I3C, formele de ciclină E cu masă moleculară mai mică de 35-/33-kDa sunt asociate cu CDK2, care s-a dovedit că conferă hiperactivitate complexului proteic CDK2 și crește proliferarea celulară (27). În schimb, după tratamentul cu I3C, forma predominantă a ciclinei E este o specie de masă moleculară mai mare de 50 kDa care produce un complex proteic CDK2 inactiv (29). Astfel, tratamentul I3C restabilește controlul fazei G1 a ciclului celular în celulele cancerului de sân uman prin promovarea acumulării ciclinei E de 50 kDa în locul formelor de masă moleculară inferioară a ciclinei E.

Rezultate

I3C inhibă direct activitatea elastazei umane și prelucrarea proteinei ciclinei E.

Folosind testul de procesare in vitro a ciclinei E, efectele inhibitoare ale I3C asupra activității elastazei neutrofile umane au fost comparate cu inhibitori de elastază bine caracterizați, elastatinal (Elast) și metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-clorometilcetonă (CMK) (37, 38 ). Așa cum se arată în FIG. 1C, I3C a fost la fel de eficient ca elastatinal sau CMK în prevenirea procesării dependente de elastază a ciclinei 50-kDa E. În absența oricăror inhibitori ai elastazei, forme de ciclină E cu greutate moleculară mai mică pot fi detectate într-o elastază. mod dependent (ADN Cyc E vs. benzi elastază DMSO).

Specificitatea indolului inhibării elastazei.

Specificitatea indolului inhibiției I3C a activității enzimatice a elastazei. (A) Analiza de citometrie în flux a celulelor MDA-MB-231 tratate 72 de ore cu controlul vehiculului DMSO, 100 μM I3C, 30 μM DIM sau 100 μM triptofol. (B) Celulele MDA-MB-231 au fost tratate cu 100 μM I3C, 30 μM DIM, 100 μM triptofol sau controlul vehiculului DMSO timp de 72 de ore. Jumătate din ciclina E imunoprecipitată a fost evaluată pentru activitatea kinazei CDK2 asociate utilizând Histona H1 ca substrat in vitro, iar cealaltă jumătate a fost analizată pentru formularea ciclinei E prin Western blots. (C) Efectele indolilor asupra procesării elastazei neutrofile umane a ciclinei E au fost analizate utilizând un sistem de transcriere-traducere in vitro, așa cum este descris. Amestecurile de reacție indicate conțineau controlul vehiculului DMSO, 50 μM I3C, 30 μM DIM sau 50 μM triptofol.

Testul de procesare a proteinei ciclinei E in vitro folosind elastază purificată a fost utilizat pentru a evalua indolul selectiv de inhibare a elastazei. Așa cum se arată în FIG. 2C, I3C a inhibat procesarea in vitro a ciclinei E mediată de elastază prin aceea că nivelul ciclinei E de 50 kDa rămas a fost similar cu cel detectat în absența oricărei elastaze adăugate (banda ADN Cyc E). În contrast, în prezența DIM sau a triptofolului, procesarea mediată de elastază a ciclinei E de 50 kDa a fost similară cu reacțiile de procesare in vitro de control ale vehiculului, ceea ce demonstrează că activitatea elastazei nu a fost inhibată de nici o moleculă. Zimografia elastazei purificate a confirmat aceste rezultate, prin faptul că I3C, dar nu DIM sau triptofolul, a inhibat direct activitatea elastazei (datele nu sunt prezentate).

I3C acționează ca un inhibitor necompetitiv al activității enzimatice a elastazei umane.

Analiza cinetică a inhibării indolului activității elastazei. (A) Testul de procesare in vitro a elastinei ciclinei E a fost utilizat pentru a determina efectele I3C asupra Km și Vmax pentru activitatea enzimatică a elastazei neutrofile umane. Elastaza umană, concentrațiile de substrat ale ciclinei E indicate și concentrația indicată de I3C au fost toate amestecate la un volum total de 20 μL și incubate timp de 5 minute la 37 ° C urmate de analiza Western blot a ciclinei E. Viteza de reacție a fost determinată ca funcția pierderii proteinei ciclinei E de 50 kDa și au fost reprezentate grafic față de concentrația ciclinei E. (B) Lineweaver - Analiza grafică Burk și Dixon a inhibiției I3C a procesării elastazei ciclinei E utilizând reacțiile de transcriere - traducere in vitro. Graficarea dublă reciprocă de 1/viteză față de 1/substrat dă graficul Lineweaver - Burk. Pentru graficele Dixon, raportul 1/V a fost reprezentat în funcție de diferitele concentrații de I3C la 2 concentrații diferite de substrat (0,6 și 1,2 ng), iar valorile Ki au fost determinate grafic ca interceptare cu abscisa. (C) Lineweaver - Analiza grafică Burk și Dixon a inhibării I3C a hidrolizei elastazei umane a substratului cromogen metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilidă (MetS).

O limitare potențială a generării proteinei ciclinei E într-un sistem de transcriere in vitro este prezența altor proteine ​​în timpul reacțiilor elastazice care ar putea modifica cinetica enzimei. Ca o confirmare complementară a inhibiției I3C necompetitive a activității elastazei folosind elastază pură și substrat pur, hidroliza substratului cromogen de elastază N-metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanalidă (MetS) (39) a fost măsurată la diferite concentrații de substrat și I3C prin spectrofotometrie. Așa cum se arată în FIG. 3C La stânga, graficele duble reciproce la diferite concentrații de I3C au afișat toate aceleași -1/Km pe abscisă, ceea ce confirmă în plus că I3C acționează ca un inhibitor de elastază necompetitiv. Valoarea Ki calculată a inhibării enzimei utilizând elastază pură în prezența substratului MetS a fost de 12,93 ± 0,4 μM (Fig. 3C Dreapta), care este o valoare similară cu valoarea calculată folosind proteina ciclină E ca substrat (Fig. 3B Dreapta).

Eliminarea siRNA a nivelurilor de elastază celulară imită inhibarea mediată de I3C a procesării proteinelor de ciclină E și a stopării ciclului celular G1 al celulelor canceroase de sân.

O predicție cheie pentru ca elastaza să fie o țintă directă I3C în celulele cancerului de sân uman este că ablația producției de proteine ​​elastază de către ARNsi ar trebui să imite efectele I3C asupra procesării proteinelor ciclinei E și controlului ciclului celular. Celulele MDA-MB-231 au fost transfectate cu un siRNA specific de elastază neutrofilă umană timp de 48 de ore, sau cu o secvență de ARNm amestecat, iar nivelul proteinei elastazei a fost monitorizat în celule transfectate cu siARN, transfectate cu ARNm și transfectate control și transfectate cu control prin imunofluorescență indirectă folosind anticorpi primari specifici anti-elastază umană și anticorpi secundari fluorescenți conjugați cu roșu Texas. Producția de elastază a fost substanțial redusă în celulele expuse la ARNs specific elastazei (Fig. 4A Dreapta sus) în comparație cu transfecția și controalele siRNA amestecate (Fig. 4A Stânga sus), arătând că siARN-ul a dărâmat semnificativ producția de elastază în cancerul de sân uman .celulele. FIG. 4A inferior prezintă colorarea DAPI a nucleelor ​​celulare de la ARNsi și celulele transfectate de control.

Ablația ARNsi a producției de elastază imită efectele I3C asupra procesării proteinelor ciclinei E și a stopării ciclului celular. (A) Celulele cancerului de sân MDA-MB-231 au fost transfectate cu sau fără siRNA specific de elastază neutrofilă umană sau cu secvențe de ARNm amestecate timp de 24 de ore, iar nivelurile rezultate de elastază celulară au fost monitorizate prin imunofluorescență indirectă. Colorarea DAPI a ADN-ului nuclear a fost utilizată ca control pentru prezența celulelor în probe tratate cu siARN și netratate. (B) siARN (elastază sau amestecată) - celule transfectate și controlate transfectate au fost apoi tratate cu sau fără 100 μM I3C timp de 48 de ore, iar extractele de celule fracționate electroforetic au fost examinate pentru nivelurile de 50-kDa și 35-/33-kDa ciclină E prin analiza Western blot. La nivelul hsp90 s-a folosit un control de încărcare a gelului. (C) siARN (elastază sau amestecate) - celule transfectate și controlate au fost apoi tratate cu sau fără 100 μM I3C timp de 48 de ore și proliferarea celulară a fost monitorizată prin citometrie în flux pentru conținutul de ADN al nucleelor ​​colorate cu iodură de propidiu.

Producerea proteinei ciclinei E 50-kDa și a proteinelor ciclinei E 35-kDa cu masă moleculară inferioară a fost analizată în celule MDA-MB-231 transfectate cu sau fără elastază sau secvențe siRNA amestecate și apoi incubate în absența sau prezența a 100 μM I3C timp de 48 de ore. Analiza Western blot a arătat că întreruperea expresiei elastazei de către ARNs a împiedicat procesarea ciclinei E în aceeași măsură ca și tratamentul cu I3C. Așa cum se arată în FIG. 4B, celulele de control (DMSO) exprimă predominant proteinele ciclinei cu greutate moleculară mai mică, în timp ce ciclina E de 50 kDa a fost forma predominantă atât în ​​celulele tratate cu elastază (siARN), cât și în celulele tratate cu I3C. Interesant este faptul că, atunci când celulele elastază transfectate cu ARNsi au fost tratate cu I3C, a apărut un efect sporit asupra nivelului proteinei ciclinei E de 50 kDa (Fig. 4B, banda I3C + siARN). Analiza citometriei de flux a relevat că ablația siRNA a expresiei elastazei a indus o oprire a ciclului celular comparabilă cu celulele incubate cu 100 μM I3C (Fig. 4C). Luate împreună, aceste rezultate demonstrează că eliminarea proteinei elastazei este suficientă pentru a crește-aresta și a perturba procesarea proteinei ciclinei E în celulele cancerului mamar uman și că inhibarea I3C a activității elastazei joacă un rol crucial în efectele ciclului celular mediate de indol.

Discuţie

Materiale și metode

Materiale, cultură celulară, citometrie în flux, Western Blots, imunoprecipitare și test enzimatic CDK.

Aceste informații sunt detaliate în textul SI. Citometria de flux a fost efectuată așa cum am descris anterior (15), iar Western blots, imunoprecipitațiile ciclinei E și testele activității enzimatice CDK2 folosind histona H1 ca substrat au fost efectuate așa cum a fost descris (29).

Testul digestiei enzimatice a elastazei umane a proteinei ciclinei transcrise/traduse in vitro.

Cinetica enzimei elastazei, utilizarea substraturilor cromogene și analiza zimografică modificată.

Descrierea efectelor I3C asupra cineticii enzimei elastazei, utilizarea proteinei ciclinei E sau a unui substrat cromogen, analiza dublă reciprocă și a graficului Dixon a inhibării I3C a activității enzimatice a elastazei și analiza zimografică modificată a activității enzimei (43) sunt detaliate în textul SI.

siRNA Knockdown of Cellular Elastase Levels.

GenarWide siRNA pentru elastaza neutrofilă umană și siRNA-ul amestecat au fost obținute de la Qiagen. Celulele MDA-MB-231 au fost însămânțate la confluență de 60% pe plăci cu 6 godeuri în medii de creștere completă în ziua transfecției. Un total de 150 ng de siARN a fost amestecat cu 100 μL de mediu de creștere care nu conțin ser și antibiotice. Reactivul de transfecție Hiperfect siARN (Qiagen) a fost adăugat la soluția de mediu siARN și amestecat prin vortexare, iar suspensiile de ARNsi rezultate au fost incubate la temperatura camerei timp de 10 minute. Amestecurile de ARNsi au fost apoi adăugate la celule într-o manieră prin picurare și amestecate prin agitare pe placă pentru a asigura distribuția uniformă a tratamentului cu ARNsi. Celulele au fost incubate la 37 ° C timp de 24 de ore și apoi mediile au fost aspirate și înlocuite cu medii de creștere completă cu sau fără 100 μM I3C timp de 48 de ore. Eficiența ablației siRNA a nivelurilor de elastază a fost determinată prin imunofluorescență indirectă cu celule placate pe lamele de cameră de sticlă (Nunc) la confluență de 60%. Imunofluorescența indirectă folosind anticorpi primari elastazici și anticorpi secundari Texas conjugați cu roșu și colorarea DAPI a nucleelor ​​celulare au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (16).

Mulțumiri

Mulțumim membrilor G.L.F. laborator pentru sugestiile lor utile pe parcursul lucrării. Acest studiu a fost sprijinit de Institutul Național de Sănătate Grant pentru Serviciul Public CA102360 de la Institutul Național al Cancerului.

Note de subsol

    1 Cui trebuie să i se adreseze corespondența. E-mail: glfireberkeley.edu

Contribuțiile autorului: L.F.B. și G.L.F. cercetare proiectată; H.H.N., I.A., G.A.B. și D.H.H.N. cercetări efectuate; și G.L.F. a scris ziarul.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Acest articol este o trimitere directă PNAS.