Rolul proliferatorului Peroxisomului - Receptor activat γ Coactivator 1α și Biogenezei mitocondriale

  1. Feng Dong,
  2. Qun Li,
  3. Nair Sreejayan,
  4. Jennifer M. Nunn și
  5. Jun Ren
  1. De la Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare și Medicină Alternativă, Universitatea din Wyoming, Laramie, Wyoming
  1. Adresați cererile de corespondență și reimprimare către Dr. Jun Ren, Centrul pentru Cercetări Cardiovasculare și Medicină Alternativă, Universitatea din Wyoming, Laramie, WY 82071. E-mail: jrenuwyo.edu

Rolul proliferatorului Peroxisomului - Receptor activat γ Coactivator 1α și Biogenezei mitocondriale

Abstract

  • EDD, diametru end-diastolic
  • ESD, diametru sistolic final
  • FFI, intensitatea fluorescenței fura-2
  • ADNmt, ADN mitocondrial
  • mtTFA, factorul de transcripție mitocondrială A
  • NRF, factor respirator nuclear
  • PGC-1α, proliferator de peroxizom - receptor activat γ coactivator-1α
  • ROS, specii reactive de oxigen
  • Sirt, regulator de informații silențios
  • TPS, timpul până la scurtarea vârfului
  • TR90, timp până la 90% întărire

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Hrana cu diete bogate în grăsimi și testul de toleranță la glucoză intraperitoneală.

Procedura experimentală descrisă aici a fost aprobată de comitetul nostru instituțional de utilizare și îngrijire a animalelor. Pe scurt, șoarecii transgenici de supraexpresie metalotioneină specifică cardiacei masculi în vârstă de 4 luni și cântărind aproximativ 20 g au fost repartizați aleatoriu în dietele cu conținut scăzut de grăsimi (10% din calorii totale) sau bogate în grăsimi (45% din calorii totale) New Brunswick, NJ) timp de 5 luni. Dieta bogată în grăsimi a fost bogată caloric (4,83 vs. 3,91 kcal/g în dieta cu conținut scăzut de grăsimi) datorită compoziției mai mari de grăsimi. Cu toate acestea, cele două diete au avut o compoziție similară de nutrienți. Șoarecii au fost adăpostiți individual într-un mediu controlat de climat, cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și acces gratuit la diete și apă. Culoarea blănii a fost utilizată ca marker pentru identificarea metalotioneinei (maro închis) sau FVB (alb) a mouse-ului. După 5 luni de hrănire, toți șoarecii au fost posti timp de 12 ore și apoi li s-a administrat o injecție intraperitoneală de glucoză (2 g/kg corp greutate). Probele de sânge au fost extrase din coadă imediat înainte de provocarea glucozei, precum și 15, 60 și 120 de minute după aceea. Nivelurile serice de glucoză au fost determinate utilizând un analizor de glucoză Accu-Chek III (15). Tensiunea arterială sistolică și diastolică a fost examinată cu un dispozitiv semi-automat, amplificat cu manșetă de coadă. Nivelurile de insulină din sânge au fost măsurate folosind un set de test imunosorbent legat de enzima insulinei de șoarece.

grăsimi

Evaluarea ecocardiografică.

Geometria și funcția cardiacă au fost evaluate la șoareci anesteziați (Avertin 2,5%, 10 μl/g corp greutate i.p.) folosind o ecocardiografie ghidată bidimensională în mod M (Sonos 5500) echipată cu un traductor liniar de 15-6 MHz. Grosimea peretelui anterior și posterior și dimensiunile diastolice și sistolice ale ventriculului stâng au fost înregistrate din imagini în modul M folosind metoda adoptată de Societatea Americană de Ecocardiografie. Scurtarea fracțională a fost calculată din diametrul end-diastolic (EDD) și diametrul end-sistolic (ESD) utilizând următoarea ecuație: (EDD - ESD)/EDD. Ritmul cardiac a fost calculat în medie pe 10 cicluri cardiace (16).

Izolarea cardiomiocitelor.

După sedarea ketaminei/xilazinei, inimile au fost îndepărtate și perfuzate cu tampon bicarbonat Krebs-Henseleit (KHB) conținând (în mmol/l): 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 10 HEPES și 11,1 glucoză. Inimile au fost digerate cu colagenază D timp de 20 de minute. Ventriculele stângi au fost îndepărtați și tocați înainte de a fi filtrate. Randamentul miocitelor a fost de ~ 75% și nu a fost afectat de dieta bogată în grăsimi sau de metalotioneină. Doar miocitele în formă de tijă cu margini clare au fost selectate pentru studiul mecanic și intracelular Ca 2+ (15).

Scurtarea/întărirea celulei.

Proprietățile mecanice ale cardiomiocitelor au fost evaluate utilizând un sistem cu margini moi IonOptix (IonOptix, Milton, MA). Miocitele au fost plasate într-o cameră montată pe stadiul unui microscop Olympus IX-70 și superfuzate (± 2 ml/min la 25 ° C) cu un tampon de bicarbonat Krebs-Henseleit conținând 1 mmol/l CaCl2. Miocitele au fost stimulate în câmp la 0,5 Hz, dacă nu se specifică altfel. Scurtarea și întărirea celulelor au fost evaluate, inclusiv scurtarea vârfurilor, indicând contractilitatea maximă; time-to-PS (TPS), indicând durata contracției; întărirea timpului până la 90% (TR90), indicând durata relaxării; și viteze maxime de scurtare/întărire (± dL/dt), indicând dezvoltarea și declinul presiunii maxime (15).

Tranzitori intracelulari Ca 2+.

O cohortă de miocite a fost încărcată cu fura-2/AM (0,5 μmol/l) timp de 10 minute, iar intensitatea fluorescenței a fost înregistrată cu un sistem de fotomultiplicare cu fluorescență cu dublă excitație (Ionoptix). Miocitele au fost plasate pe un microscop inversat Olympus IX-70 și au fost realizate printr-un obiectiv Fluor × 40 cu ulei. Celulele au fost expuse la lumina emisă de o lampă de 75W și au trecut fie printr-un filtru de 360, fie de 380 nm, în timp ce au fost stimulate să se contracte la 0,5 Hz. Emisiile de fluorescență au fost detectate între 480 și 520 nm, iar schimbarea calitativă a intensității fluorescenței fura-2 (FFI) a fost dedusă din raportul FFI la cele două lungimi de undă (360/380). Timpul de descompunere a fluorescenței (decădere simplă sau bi-exponențială) a fost calculat ca indicator al compensării intracelulare a Ca 2+ (15).

Analiza producției ROS.

Producția de ROS celular a fost evaluată prin analiza modificărilor intensității fluorescenței rezultate din oxidarea fluoroprobei intracelulare DCF [5- (6) -chlorometil-2 ', 7'-diclorodihidrofluoresceină diacetat]. Pe scurt, cardiomiocitele au fost încărcate cu 10 μmol/l DCF la 37 ° C timp de 30 de minute. Miocitele au fost clătite și intensitatea fluorescenței a fost apoi măsurată folosind un cititor de microplacă fluorescentă la o lungime de undă de excitație de 480 nm și o lungime de undă de emisie de 530 nm. Celulele netratate nu au prezentat fluorescență și au fost utilizate pentru a determina fluorescența de fond (17).

Microscopie electronică de transmisie.

Ventriculii stângi au fost fixați cu 2,5% glutaraldehidă/1,2% acroleină în tampon fixativ (0,1 mol/l cacodilat, 0,1 mol/l zaharoză, pH 7,4) și 1% tetroxid de osmiu, urmat de 1% acetat de uranil, și deshidratat printr-o serie gradată de concentrații de etanol înainte de a fi încorporate în rășina LX112 (LADD Research Industries, Burlington, VT). Secțiuni ultra-subțiri (~ 50 nm) au fost tăiate pe ultramicrotom, colorate cu acetat de uranil urmat de citrat de plumb și vizualizate pe un microscop electronic cu transmisie Hitachi H-7000 echipat cu o cameră digitală cu dispozitiv cuplat cu încărcare răcită 4K × 4K (18 ). Analizele cantitative ale dimensiunii și densității mitocondriale au fost efectuate la o mărire de × 4.000. O medie de șase până la șapte câmpuri vizuale a fost evaluată pentru fiecare inimă de șoarece.

Analiza Western blot.

Proteina a fost preparată așa cum este descris (15). Un subset de cardiomiocite de la șoareci FVB și metalotioneină a fost incubat pentru prima dată la 37 ° C cu acid palmitic liber de acizi grași (1 mmol/l) (a se vedea metodele suplimentare online [disponibile la http://dx.doi.org/10.2337/db06- 1596] pentru prepararea acidului palmitic) timp de 24 de ore înainte de determinarea expresiei PGC-1α. Probele care conțin cantități egale de proteine ​​au fost separate pe geluri SDS-poliacrilamidă 10% într-un aparat de minigel (Mini-PROTEAN II; Bio-Rad) și transferate în membranele de nitroceluloză. Membranele au fost blocate cu lapte 5% în soluție salină tamponată cu Tris cu Tween și au fost incubate peste noapte la 4 ° C cu anti-Akt, anti-pAkt, anti-Foxo1a, anti-pFoxo1a (Thr24), regulator de informații anti-silențios (Sirt ), anti-Foxo3a, anti-pFoxo3a (Thr32), PGC-1α (toate la 1: 1.000) și anti-β-actină (1: 5.000). După imunoblotare, filmul a fost scanat și intensitatea benzilor imunoblotate a fost detectată cu un densitometru calibrat Bio-Rad.

Extracția totală a ARN-ului, sinteza ADNc, transcrierea inversă și PCR în timp real.

Determinarea numărului de copie ADNmt.

Cantitatea relativă a numărului de copii ADN mt de inimă a fost determinată utilizând RT-PCR așa cum este descris (20). ADN-ul total a fost extras folosind un kit de țesut Qiagen DNeasy; A fost utilizat 10 ng ADN, iar mitocondria nicotinamidă adenină dinucleotidă dehidrogenază-5 (ND-5) a fost gena țintă. Grundele pentru ND-5 au fost: înainte 5'TGG ATG ATG GTA CGG ACG AA-3 ', invers 5'-TGC GGT TAT AGA GGA TTG CTT GT-3'. RT-PCR calitativ a fost efectuat folosind un termociclator BioRad în timp real cuplat cu tehnologia SYBR Green și următorii parametri de ciclare: etapa 1, 50 ° C timp de 2 minute; etapa 2, 95 ° C timp de 10 min; și etapa 3, 40 de cicluri la 95 ° C timp de 15 secunde și la 55 ° C timp de 45 secunde. Fiecare probă a fost analizată în duplicat. Numărul de copii mitocondriale relativ la numărul de copii nucleare a fost evaluat printr-o metodă comparativă a ciclului de prag, folosind β-actina ca control intern.

Analiza datelor.

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM. Compararea statistică a fost efectuată de ANOVA, urmată de testul post-hoc Newman-Keuls. Semnificația a fost stabilită la proprietățile P 2+.

Nici o dietă bogată în grăsimi, nici metalotioneina nu au afectat lungimea miocitelor în repaus. Hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi a redus semnificativ scurtarea vârfului și ± dL/dt, precum și TR90 prelungit, fără a afecta TPS în cardiomiocitele șoarecilor FVB, oarecum amintind de constatările noastre anterioare (8). Foarte important, metalotioneina a abolit alimentația cu conținut ridicat de grăsimi - anomalii mecanice induse (Fig. 2). În plus, cardiomiocitele de la șoarecii hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi au prezentat o creștere semnificativă a valorii inițiale a Ca 2+ intracelulară, o creștere depresivă a Ca 2+ intracelulară ca răspuns la stimulul electric (ΔFFI) și o reducere a ratei de decădere intracelulară Ca 2+ (fie unică, fie bi potrivirea exponențială a curbei). Metalotioneina a negat regimul alimentar bogat în grăsimi - prelungirea indusă în decaderea intracelulară Ca 2+ și depresia în ΔFFI cu efect redus asupra FFI de bază crescută. Metalotioneina în sine nu a afectat niciuna dintre proprietățile intracelulare de Ca 2+ testate (Fig. 3).

Efectul dietei bogate în grăsimi și a metalotioneinei asupra relației de stimulare a frecvenței de scurtare.

Inimile mouse-ului bat la frecvențe înalte (> 400/min la 37 ° C). Pentru a investiga posibila deranjare a cuplării excitației-contracției cardiace la frecvențe mai mari, frecvența de stimulare a fost crescută treptat de la 0,1 la 5 Hz (300 bătăi/min). Celulele au fost inițial stimulate să se contracte la 0,5 Hz timp de 5 minute pentru a asigura starea de echilibru înainte de a începe protocolul de frecvență. Toate înregistrările au fost normalizate la scurtarea maximă obținută la 0,1 Hz din aceeași celulă. Miocitele din grupul bogat în grăsimi au prezentat o depresie semnificativ exagerată în scurtarea vârfurilor la 3,0 și 5,0 Hz fără modificări la frecvențe joase. Metalotioneina transgenă în sine a exercitat un efect redus la toate frecvențele testate. Cu toate acestea, a abrogat depresia indusă de dietă bogată în grăsimi în scurtarea maximă la 3,0 și 5,0 Hz (Fig. 3E).

Efectul dietei bogate în grăsimi și a metalotioneinei asupra caracteristicilor microscopice electronice ale inimilor.

Fără tratament dietetic bogat în grăsimi, nu s-a observat nicio diferență ultrastructurală în probele cardiace între grupurile FVB și metalotioneină (Fig. 4A și B). Hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi a declanșat leziuni focale extinse în inimile șoarecilor FVB, caracterizate prin umflarea mitocondrială, dezorganizarea cristelor și pierderea integrității sarcomere (Fig. 4C). În concordanță cu observația mecanică, metalotioneina a negat dieta cu conținut ridicat de grăsimi - leziuni structurale cardiace induse (Fig. 4D). Țesuturile miocardice din dietă bogată în grăsimi - șoareci metalotioneinici hrăniți nu s-au putut distinge ultrastructural de grupurile dietetice cu conținut scăzut de grăsimi. Analiza cantitativă a relevat că dieta bogată în grăsimi a redus semnificativ densitatea, dar nu și dimensiunea mitocondriilor din inimile șoarecilor FVB, al căror efect a fost anulat de metalotioneină (Fig. 4E și F).

Expresie în factorii din aval Akt, pAkt, PGC-1α, Sirt și PGC-1α și numărul copiei ADNmt.

Efectul acidului palmitic asupra expresiei PGC-1α în cardiomiocite de șoarece FVB și metalotioneină.

Pentru a examina cauzalitatea în protecția provocată de metalotioneină împotriva dietei bogate în grăsimi - reglarea descendentă a PGC-1α indusă, am efectuat un studiu in vitro pentru a incuba cardiomiocitele cu acid palmitic (1 mmol/l) timp de 24 de ore. Imunoblotii noștri au dezvăluit că acidul palmitic a reglat semnificativ expresia PGC-1α în FVB, dar nu și în șoarecii metalotioneinici (Fig. 5F), sugerând că acizii grași liberi pot regla direct coactivatorul de biogeneză mitocondrială și pot juca un rol în dieta bogată în grăsimi - efecte provocate asupra PGC-1α.

Exprimarea factorilor transcripționali Forkhead Foxo1a și Foxo3a.

Se știe că PGC-1α interacționează cu o serie de căi de semnalizare, inclusiv factorii transcripționali Forkhead, care pot fi coactivate de PGC-1α în reglarea genelor gluconeogene și biosintetice hem (21). Evaluarea în expresia factorilor transcripționali Forkhead Foxo1a și Foxo3a a relevat că alimentația cu conținut ridicat de grăsimi a îmbunătățit semnificativ fosforilarea Foxo3a fără a afecta expresia totală a proteinelor Foxo1a și Foxo3a, precum și fosforilarea Foxo1a. Metalotioneina nu a reușit să modifice nici forma totală, nici fosforilată a ambilor factori transcripționali Forkhead în cadrul unui regim cu conținut scăzut sau ridicat de grăsimi (Fig. 7).

DISCUŢIE

În studiul nostru actual, dieta bogată în grăsimi a indus fosforilarea Foxo3a fără modificări în cascada Akt, fosforilarea Foxo1a și expresia totală Foxo3a. Akt este un factor esențial de supraviețuire cardiacă pentru menținerea funcției contractile cardiace (32). Cu toate acestea, datele noastre nu au favorizat niciun rol major al Akt și al semnalului său din aval Foxo în cardioprotecția oferită de metalotioneină împotriva consumului de diete bogate în grăsimi. Deși observația noastră privind fosforilarea îmbunătățită a Foxo3a pare să coincidă cu hipertrofia cardiacă sub aport ridicat de grăsimi datorită inhibării apoptozei mediată de Forkhead, faptul că metalotioneina protejează hipertrofia cardiacă și disfuncția miocardică împotriva aportului ridicat de grăsimi fără a afecta nivelurile crescute de pFoxo3a sugerează contribuția a mecanismelor alternative sau compensatorii. De fapt, sa demonstrat recent că regulatorul mitocondrial PGC-1α suprimă factorul transcripțional Foxo3 și participă la proteoliza lizozomală și degradarea proteinelor (14). Cu toate acestea, studiul nostru nu a identificat interacțiunea dintre factorii de transcripție PGC-1α și Forkhead.

În ceea ce privește limitările experimentale, în mod ideal, șoarecii cu diferite niveluri de metalotioneină modificate farmacologic sau genetic ar trebui să contribuie la demonstrarea existenței unei relații solide între alimentarea cu diete bogate în grăsimi, integritatea mitocondrială și funcția miocardică. Cu toate acestea, șoarecii transgenici cu niveluri diferite de metalotioneină nu sunt ușor disponibile, în timp ce inducerea farmacologică a metalotioneinei folosind zinc este mai degrabă nespecifică sau potențial toxică. Incubarea noastră in vitro a acidului gras palmitic liber nu poate reflecta cu adevărat schimbările metabolice provocate de alimentația cronică cu conținut ridicat de grăsimi. Datorită dificultății tehnice, nu am putut evalua funcția cardiomiocitelor murine după 24 de ore de tratament cu acid palmitic, care ar oferi informații esențiale pentru un defect miocardic indus de o dietă bogată în grăsimi. Nu în ultimul rând, sa raportat recent că resveratrolul îmbunătățește funcția mitocondrială prin scăderea acetilării PGC-1α și, prin urmare, a crescut activitatea PGC-1α (33). Cu toate acestea, rezultatele noastre nu au favorizat niciun rol al proteinei deacetilază Sirt în dieta bogată în grăsimi - și a răspunsului provocat de metalotioneină, indicând că mecanisme disparate pot fi prezente pentru reglarea PGC-1α.

În concluzie, studiul nostru a oferit dovezi pentru prima dată că disfuncția contractilă miocardică, manipularea intracelulară a Ca 2+, acumularea ROS, deteriorarea mitocondrială și pierderea densității mitocondriale și a conținutului de ADNmt în obezitatea indusă de grăsimi sunt asociate îndeaproape cu reglarea descendentă a coactivator de biogeneză mitocondrială PGC-1α și factorii săi nucleari din aval. Având în vedere protecția provocată de metalotioneină împotriva disfuncției cardiace induse de conținut ridicat de grăsimi sau acid palmitic, precum și reglarea descendentă a regulatorului principal al biogenezei mitocondriale PGC-1α și a factorilor săi nucleari din aval, datele noastre susțin noua ipoteză că aportul alimentar (posibil rezistența la insulină și diabetul de tip 2) afectează biogeneza mitocondrială, ceea ce poate explica patogeneza funcției miocardice aberante sub obezitate, rezistență la insulină și diabet zaharat. Este imperativ să înțelegem reglarea PGC-1α și a biogenezei mitocondriale sub stres oxidativ și terapie antioxidantă, astfel încât strategia de tratament să aibă drept scop realizarea unei inducții suficiente a PGC-1α într-o fereastră benefică terapeutic.