Editat de Roger H. Unger, Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX și aprobat la 26 ianuarie 1998 (primit pentru revizuire la 26 noiembrie 1997)

induse

Abstract

Obezitatea este o tulburare a echilibrului energetic în care aportul de energie este mai mare decât cheltuielile de energie. Metodele de control al obezității prin limitarea aportului de energie au avut un succes modest în cel mai bun caz și este recunoscut pe scară largă că cheltuielile de energie trebuie crescute la un individ obez dacă se va realiza o pierdere în greutate pe termen lung. Descoperirea recentă a mai multor proteine ​​noi de decuplare (UCP) oferă noi ținte moleculare pentru creșterea cheltuielilor de energie. UCP sunt proteine ​​de membrană integrale ale membranei interioare mitocondriale, unde funcționează ca un canal de protoni sau o navetă. Aceste proteine ​​separă procesul respirației mitocondriale de fosforilarea oxidativă, diminuând producția rezultată de ATP și producând în schimb căldură disipativă. Acțiunea acestor proteine ​​creează un ciclu inutil care scade eficiența metabolică a organismului. Astfel, UCP sunt potențial importante în tulburările de echilibru energetic, cum ar fi obezitatea și diabetul (1, 2).

Consumul unei diete bogate în grăsimi este asociat cu o creștere a expresiei UCP2 în țesutul adipos al tulpinii A/J rezistente la obezitate a șoarecilor, dar nu și în tulpina B6 predispusă la obezitate și diabet (2). Mai mult, un locus pe cromozomul uman 11q13, care este sintenic cu locusul UCP2 pe cromozomul 7 de șoarece, a fost recent legat de rata metabolică la om (12). Studiile de cartografiere cromozomială plasează acum genele UCP2 și UCP3 umane și de șoareci în imediata apropiere una de cealaltă a cromozomului uman 11 și respectiv a cromozomului 7 șoarecelui (11). Prin urmare, atât UCP2, cât și UCP3 reprezintă gene candidate pentru locusul trăsăturilor cantitative ale obezității și diabetului indus de dietă la șoareci (2, 13) și la oameni. În lucrarea descrisă aici, raportăm că grăsimea alimentară crește în mod specific expresia UCP2 în WAT, dar nu și în mușchiul scheletic sau BAT, în două tulpini de șoarece rezistente la obezitate și diabet (A/J și KsJ) fără niciun efect asupra UCP2 țesut al șoarecelui B6. Spre deosebire de UCP2, consumul unei diete bogate în grăsimi nu afectează expresia UCP3 în WAT, mușchi scheletic sau BAT.

MATERIALE ȘI METODE

Animale.

Șoarecii masculi (20 șoareci) din fiecare tulpină B6, A/J și KsJ au fost obținuți de la Laboratorul Jackson la vârsta de 4 săptămâni. Animalele au fost adăpostite câte cinci pe cușcă într-o cameră cu temperatură controlată, cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (luminile stinse la ora 17:00). Hrana și apa erau disponibile ad libitum. Șoarecii au fost hrăniți cu una dintre cele două diete după cum urmează: 10 șoareci din fiecare tulpină au fost plasați pe o dietă cu conținut scăzut de grăsimi/zaharoză sau cu o dietă bogată în grăsimi/săracă în zaharoză. Compoziția acestor diete a fost descrisă (14). După 2 săptămâni în aceste diete, animalele au fost anesteziate și ucise prin decapitare, iar țesuturile au fost colectate rapid, curățate și omogenizate în tampon izotiocianat de guanidină 4 M pentru prepararea ARN-ului celular total (15). O altă cohortă de animale a fost crescută în aceste diete timp de 5 luni pentru măsurători ale greutății corporale, a glucozei plasmatice în post și a nivelurilor de insulină, așa cum este descris (16).

Cartografierea genomică a mouse-ului UCP3 în raport cu UCP2.

Poziția cromozomială a UCP3 a fost determinată prin maparea legăturii polimorfismelor de lungime a fragmentului de restricție într-o cruce interspecifică, așa cum este descris pentru UCP2 de șoarece (2). UCP3 s-a dovedit a se cosegrega cu UCP2 în această analiză (M. Seldin și C. Warden, comunicare personală). Am clonat un ADNc de șoarece UCP3 care conține toți cei șapte exoni dintr-o bibliotecă de ADNc de mușchi de șoarece construită în λ gt11 (biblioteca CLONTECH ML3006b). Secvența acestui ADNc UCP3 a fost depusă în baza de date GenBank sub numărul de acces. AF032902 (D.S., C. Fleury, F. Bouillaud și D.R., date nepublicate). Organizarea locusului UCP3/UCP2 a fost studiată utilizând analiza PCR a ADN-ului genomic de la șoareci B6 sau șoareci 129/SvJ. Aceleași date au fost obținute din ambele surse de ADN genomic. Exemplul de sens (5'-CGGGAATCTCCGTTTTGAAC → 3 ′) utilizat în PCR a cuprins codonul de oprire al UCP3, care este 264 bp în amonte de la sfârșitul exonului 7 al UCP3, conform secvenței mouse-ului UCP3 cDNA. Exemplul invers (5'-ATGAATGGACTCCACTGAGC → 3 ') a corespuns pozițiilor -7083 la -7063 ale genei UCP2 (în raport cu site-ul de început transcripțional UCP2). S-a obținut un produs PCR de 1,2 kb și acest produs a fost secvențiat.

Izolarea și analiza ARN-ului.

ARN celular total a fost preparat prin metoda gradientului de clorură de cesiu așa cum este detaliat (15). Pentru hibridizarea Northern blot, ARN-ul a fost denaturat prin procedeul glioxal, fracționat prin geluri de agaroză 1,2% și șters pe membranele de nailon Biotrans (ICN) așa cum este descris (17). Fragmentele de ADN care au fost utilizate ca sonde de hibridizare au fost obținute din următoarele surse. Am folosit un produs PCR de 950-bp al ADNc-ului UCP2 de șoarece și un fragment de 244-bp al UCP3 de șoarece care codifică ultimii 70 de aminoacizi ai proteinei. Această sondă UCP3 nu se hibridizează încrucișat cu UCP2. Pentru UCP1, a fost utilizat un fragment BglII de 300 bp, furnizat cu amabilitate de Leslie P. Kozak (Laboratorul Jackson, Bar Harbor, ME) (18). O sondă ADNc de șobolan pentru ciclofilină a fost utilizată ca standard intern de hibridizare/cuantificare (19). Sondele radiomarcate au fost preparate prin marcarea aleatorie a primerului (MultiPrime, Amersham) a fragmentelor de ADN purificat în prezența [32 P] dCTP la o activitate specifică de ± 2 × 10 9 dpm/μg ADN. Bloturile au fost hibridizate și spălate așa cum este descris în alte rapoarte (17, 19). Intensitatea semnalelor de hibridizare a fost cuantificată de Phosphorimager (ImageQuant/Storm, Foster City, CA) și normalizată la valorile pentru ciclofilină. Imaginile permanente ale petelor au fost realizate prin expunerea la filmul Kodak BioMax.

REZULTATE SI DISCUTII

În raportul nostru privind clonarea și activitatea funcțională a genei UCP2 (2), am observat că, în decurs de o săptămână de la hrănirea unei diete bogate în grăsimi, șoarecii A/J au prezentat o expresie crescută a UCP2 în WAT, în timp ce șoarecilor B6 nu le-a fost răspuns dieta timp de cel puțin 5 săptămâni. Deoarece am identificat o legătură genetică în vecinătatea locusului UCP2 pe cromozomul 7 de șoarece care este asociată cu dezvoltarea obezității severe și a diabetului zaharat în tulpina B6, am emis ipoteza că expresia crescută a UCP2 în țesutul adipos al șoarecilor A/J preveni obezitatea cheltuind calorii ca căldură în loc să mărești masa țesutului adipos.

Organizarea genomică a genelor UCP3 și UCP2 de șoarece. Gena UCP3 de șoarece este 5 ′ în raport cu gena UCP2. Distanța dintre cele două gene este apropiată de 8 kb. Această organizare și calcularea distanței dintre cele două gene a fost prezisă din experimentele PCR pe ADN genomic de la două tulpini diferite de șoareci (vezi Materiale și metode). Cifrele romane corespund exonilor. Poziția +1 se referă la locul de pornire transcripțional al genei UCP2 de șoarece determinată din exemple de experimente de extensie (S.R., C. Pecqueur și D.R., date nepublicate). Pentru structura genomică UCP2, o clonă genomică denumită clona mmU2L2 a fost izolată dintr-o bibliotecă genomică de șoarece 129/SvJ în vectorul λ FIXIT (biblioteca Stratagene 946306) și complet secvențiată. Clona mmU2L2 conține 7,1 kb de ADN în amonte de la locul de pornire transcripțional (S.R. și D.R., date nepublicate).

Exprimarea UCP2 și UCP3 în mușchiul scheletic al șoarecilor KsJ, B6 și A/J. După 2 săptămâni de dietă cu conținut scăzut de grăsimi sau cu un conținut ridicat de grăsimi, ARN celular total a fost preparat din mușchiul gastrocnemius și soleus și examinat pentru expresia UCP2, UCP3 și ciclofilină prin hibridizare Northern blot. (A) Pete nordice reprezentative. (B) Media rezultatelor pentru UCP2 de la patru șoareci din fiecare tulpină. (C) Media rezultatelor pentru UCP3 de la patru șoareci din fiecare tulpină. Nu au existat diferențe semnificative statistic între oricare dintre valori prin testele ANOVA sau t asociate.

Exprimarea UCP1, UCP2 și UCP3 în IBAT de șoareci B6 și A/J. După 2 săptămâni, fie cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi, fie cu un conținut ridicat de grăsimi, ARN celular total a fost preparat din IBAT și examinat pentru expresia UCP1, UCP2, UCP3 și ciclofilină prin hibridizare Northern blot. (A) Pete nordice reprezentative. (B - D) Media rezultatelor pentru fiecare UCP de la șase șoareci din fiecare tulpină. ∗, nivelurile UCP1 la șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi au fost mai mari decât la șoarecii cu conținut scăzut de grăsimi (B6: P † R.S.S. și S.W. au contribuit în mod egal la această lucrare.

Cui ¶ Cui îi trebuie adresată corespondența la: Duke University Medical Center, Box 3557, Durham, NC 27710. e-mail: scogalactose.mc.duke.edu .

Această lucrare a fost trimisă direct (pista II) la biroul de proceduri.

Abrevieri: UCP, proteine ​​de decuplare; BAT, țesut adipos maro; WAT, țesut adipos alb; IBAT, BAT interscapulară.

Depunerea datelor: Secvența raportată în această lucrare a fost depusă în baza de date GenBank (nr. De acces AF032902).