Departamentul de afiliere pentru bioștiințe farmaceutice, Școala de farmacie, Universitatea din Oslo, Oslo, Norvegia

myotuburile

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Yuan Z. Feng, Natasa Nikolić

Departamentul de afiliere pentru bioștiințe farmaceutice, Școala de farmacie, Universitatea din Oslo, Oslo, Norvegia

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Yuan Z. Feng, Natasa Nikolić

Departamentul de afiliere pentru bioștiințe farmaceutice, Școala de farmacie, Universitatea din Oslo, Oslo, Norvegia

Departamentul de afiliere pentru bioștiințe farmaceutice, Școala de farmacie, Universitatea din Oslo, Oslo, Norvegia

Affiliation Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité Mixte de Recherche 1048, Laborator de cercetare a obezității, Institutul de boli metabolice și cardiovasculare, Universitatea din Toulouse, Toulouse, Franța

Departamentul de afiliere pentru bioștiințe farmaceutice, Școala de farmacie, Universitatea din Oslo, Oslo, Norvegia

Departamentul de afiliere pentru bioștiințe farmaceutice, Școala de farmacie, Universitatea din Oslo, Oslo, Norvegia

Afiliație Facultatea de Sănătate, Oslo și Colegiul de Științe Aplicate al Universității Akershus, Oslo, Norvegia

Afiliere Centrul Morbid Obesity, Vestfold Hospital Trust, Tønsberg, Norvegia

Afiliere Centrul de obezitate morbidă, Vestfold Hospital Trust, Tønsberg, Norvegia

Departamentul de afiliere pentru bioștiințe farmaceutice, Școala de farmacie, Universitatea din Oslo, Oslo, Norvegia

Afiliații Centrul de obezitate morbidă, Vestfold Hospital Trust, Tønsberg, Norvegia, Departamentul de farmacologie, Institutul de medicină clinică, Facultatea de medicină, Universitatea din Oslo și Spitalul universitar din Oslo, Oslo, Norvegia

Departamentul de Afișări al Bioștiințelor Farmaceutice, Școala de Farmacie, Universitatea din Oslo, Oslo, Norvegia, Departamentul de Farmacologie, Institutul de Medicină Clinică, Facultatea de Medicină, Universitatea din Oslo și Spitalul Universitar Oslo, Oslo, Norvegia

Afiliație Facultatea de Sănătate, Oslo și Colegiul de Științe Aplicate al Universității Akershus, Oslo, Norvegia

  • Cyril S. Bakke,
  • Yuan Z. Feng,
  • Natasa Nikolic,
  • Eili T. Kase,
  • Cedric Moro,
  • Camilla Stensrud,
  • Lisbeth Damlien,
  • Marianne O. Ludahl,
  • Rune Sandbu,
  • Brita Marie Solheim

Cifre

Abstract

Citare: Bakke SS, Feng YZ, Nikolic N, Kase ET, Moro C, Stensrud C și colab. (2015) Myotuburile de la subiecții diabetici de tip 2 cu obezitate severă acumulează mai puține lipide și prezintă o rată lipolitică mai mare decât miotuburile de la subiecții non-diabetici cu obezitate severă. PLoS ONE 10 (3): e0119556. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119556

Editor academic: Giorgio Sesti, Universitatea Magna Graecia din Catanzaro, ITALIA

Primit: 5 septembrie 2014; Admis: 14 ianuarie 2015; Publicat: 19 martie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de granturi de la Consiliul Norvegian de Cercetare, Oslo și Colegiul de Științe Aplicate al Universității Akershus. Autorii vor mulțumi, de asemenea, NBS (societatea biochimică norvegiană) și Diabetesforbundet pentru contribuțiile lor. CM este susținut de subvenții de la Agenția Națională de Cercetare ANR-12-JSV1-0010-01 și Société Francophone du Diabéte. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Supraponderabilitatea și obezitatea sunt puternic asociate cu rezistența la insulină și diabetul de tip 2, iar majoritatea subiecților cu diabet de tip 2 sunt clasificate ca supraponderale sau obeze [1]. Cu toate acestea, un studiu efectuat la Centrul pentru obezitate morbidă din Norvegia a arătat că doar 31% dintre pacienții cu obezitate severă înscriși pentru screening (IMC> 35 kg/m 2) aveau diabet de tip 2 [2]. Multe organe sunt implicate în diabetul de tip 2 legat de obezitate, dar mușchii scheletici sunt unul dintre organele în care rezistența la insulină este cea mai importantă.

Se cunoaște că miotuburile din cultură mențin multe caracteristici fenotipice ale donatorului. Am vrut să studiem capacitatea de stocare și de rotație a lipidelor, precum și oxidarea și flexibilitatea metabolică a miotuburilor de la obezi severi cu și fără diabet de tip 2, pentru a vedea dacă manipularea lipidelor este inerent diferită între cei care dezvoltă diabet de tip 2 și cei care nu.

Materiale și metode

Materiale

Caracteristicile donatorului

Biopsiile musculare au fost obținute de la subiecții supuși unei intervenții chirurgicale bariatrice la Morbid Obesity Center de la Vestfold Hospital Trust, Norvegia. Biopsiile au fost obținute după aprobarea scrisă informată și aprobarea de către Comitetul regional pentru etică în cercetarea medicală și de sănătate, Oslo, Norvegia (aprobarea S-09078d). Probele de sânge au fost prelevate cu o zi înainte de recuperarea biopsiei sau mai devreme (interval de la 1 lună la 2 ani, mediană de 1,5 ani), din motive practice. Diagnosticul diabetului de tip 2 s-a bazat pe glucoza plasmatică în repaus alimentar ≥ 7,0 mM, HbA1c ≥ 6,5% și/sau utilizarea unuia sau mai multor medicamente antidiabetice. Dintre cei 14 donatori din grupul diabetic de tip 2, 6 au fost în monoterapie cu metformină, 2 pe metformină și glimepiridă, 1 pe metformină în combinație cu rosiglitazonă, 1 pe monoterapie cu pioglitazonă, 2 pe insulină și 2 au fost netratați. Donatorii nu au primit medicamente în ziua operației.

Cultivarea celulelor

Celulele satelit au fost izolate din M. obliquus internus abdominis și cultivate așa cum s-a descris anterior [28]. Experimentele au fost efectuate după 7-8 zile de diferențiere și s-au adăugat 100 μM OA în ultimele 24 de ore de diferențiere. Concentrația de proteine ​​din fiecare probă a fost determinată [29], iar rezultatele au fost standardizate în funcție de această valoare pentru fiecare godeu. Nu toți donatorii au fost incluși în fiecare set de experimente, dar au fost folosiți 5-8 donatori din fiecare grup și aceștia au fost atent asortați în funcție de vârstă și IMC.

Absorbția de deoxiglucoză

Miotuburile au fost preincubate timp de 1 oră în insulină DMEM-Glutamax fără ser (5,5 mM glucoză) ± 100 nM insulină la 37 ° C înainte de adăugarea de [3H] deoxiglucoză (37 kBq, 0,1 μM) în prezența sau absența insulinei 100 nM. Absorbția de deoxiglucoză a fost măsurată timp de 1 oră așa cum s-a descris anterior [30].

Test de proximitate scintilație

Testul de scintilație de proximitate (SPA) a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [31] cu [1-14 C] acid oleic (OA) (18,5 kBq, 100 μM) în mediu fără fenol roșu. Pe scurt, [14 C] OA preluat și acumulat de celulele aderente va fi concentrat aproape de scintilatorul încorporat în fundul de plastic al fiecărei godeuri (Scintiplate, Perkin Elmer) și va oferi un semnal mai puternic decât cel dizolvat numai în mediu [32] . Acumularea de lipide a fost monitorizată până la 24 de ore cu scintilație lichidă. Ulterior, celulele au fost spălate de două ori cu DPBS cu 0,5% BSA și incubate în DPBS fără radioactivitate și măsurătorile de scintilație lichidă au fost monitorizate până la 3 ore. Scăderea [14 C] OA prezentă în celule în prezența triacsinei C (lipoliză totală, 10 μM) [33] a fost determinată, înainte de a fi evaluată radioactivitatea asociată celulei (CA) rămase. Declinul în [14 C] OA reprezintă radioactivitatea eliberată de celule și oferă o măsură a lipolizei. Triacsin C inhibă acil-CoA sintetaza grasă cu lanț lung și, prin urmare, va inhiba, printre alte căi, reesterificarea.

Distribuția lipidelor

Miotuburile au fost incubate cu 100 μM OA (18,5 kBq, 100 μM) timp de 24 de ore. Miotuburile au fost apoi spălate de două ori cu PBS și recoltate cu două adăugiri de 125 pl de apă distilată. Lipidele celulare au fost extrase așa cum s-a descris anterior [5]. Pe scurt, fracțiile celulare omogenizate au fost extrase, lipidele au fost separate prin cromatografie în strat subțire și radioactivitatea a fost cuantificată prin scintilație lichidă. Cantitatea de lipide neutre a fost legată de concentrațiile totale de proteine.

Determinarea conținutului total TAG

Conținutul total de TAG din celule a fost măsurat așa cum s-a descris anterior [34]. Pe scurt, lipidele au fost extrase în diclormetan: metanol: apă (2,5: 2,5: 2,1 (v/v/v)) în prezența standardelor interne. Lipidele neutre au fost separate pe o coloană SPE (sticlă Chromabond silice pură, 200 mg), iar lipidele neutre au fost eluate cu cloroform: metanol (9: 1 (v/v)). Faza organică a fost evaporată la sec și dizolvată în 20 pl de acetat de etil. 1 μl de extract lipidic a fost analizat prin cromatografie gaz-lichid.

Analiza activității TAG hidrolazei

Activitatea hidrolazei TAG a fost măsurată pe lizatele celulare așa cum s-a descris anterior [35]. [9,10-3 H] trioleina a fost emulsionată cu fosfolipide prin sonicare și a fost utilizată pentru a determina activitatea TAG hidrolazei [5].

Imagini live

Miotuburile au fost cultivate pe plăci cu fund de sticlă cu 6 godeuri acoperite cu gel ECM. Celulele au fost incubate cu Hoechst 33258 pentru colorarea nucleelor, Bodipy 493/503 pentru colorarea lipidelor neutre și LD și MitoTrackerRed FM pentru colorarea mitocondriilor așa cum s-a descris anterior [5]. Imaginile au fost realizate aleatoriu în 25-36 de poziții pe godeu. După eliminarea agregatelor și a celulelor moarte, fiecare parametru a fost determinat din aproximativ 240 de imagini per grup donator (medie de 38 ± 4 nuclei pe imagine).

Testul oxidării substratului

Miotuburile au fost cultivate pe microplăci CellBIND cu 96 de godeuri. Substraturi, [1-14 C] OA (18,5 sau 37 kBq, 5 sau 100 μM) sau D- [14 C (U)] glucoză (37 sau 21,5 kBq, 111 sau 200 μM/l) au fost date pe parcursul a 4h de captare a CO2 cu sau fără 5 mM glucoză sau 100 μM/l OA prezent. O microplacă UniFilter-96 GF/B cu 96 de godeuri a fost montată deasupra plăcii CellBIND și producția de CO2 a fost măsurată în mediu DPBS cu 10 mM HEPES și 1 mM L-carnitină timp de 4 ore, după cum s-a descris anterior [32]. Suma de 14 CO2 și radioactivitatea CA rămasă reflectă absorbția totală a celulelor. Oxidarea incompletă a acizilor grași, evaluată ca metaboliți solubili în acid (ASM), a fost măsurată conform descrierii [31].

Parametrii metabolici

Supresibilitatea este capacitatea celulelor de a reduce oxidarea OA prin adăugarea acută de glucoză, adaptabilitatea este capacitatea de a crește oxidarea OA odată cu creșterea concentrației de OA și flexibilitatea reglată a substratului este capacitatea de a crește oxidarea OA în timp ce se trece de la „hrănit” (acid gras scăzut ), nivel ridicat de glucoză) până la condiția „post” (acid gras ridicat, fără glucoză adăugată) condiție [5].

Izolarea ARN și expresia ARNm

ARN-ul total din celule a fost izolat de trusa de izolare Agilent Total ARN conform protocolului furnizorului. ARN-ul total din biopsiile musculare a fost izolat folosind TRIzol și s-a efectuat o procedură de curățare folosind trusa RNeasy. ARN-ul a fost transcris invers cu oligo primeri folosind un bloc de căldură (25 ° C timp de 10 minute, 37 ° C timp de 1 oră și 99 ° C timp de 5 minute) sau un PerkinElmer Thermal Cycler 9600 și qPCR a fost efectuat folosind o detecție ABI PRISMT 7000 System sau un LightCycler 480 (Roche Diagnostic, Mannheim, Germania). Primerii înainte și invers folosiți la o concentrație de 30 μM sunt prezentați în tabelul S1. Nivelurile de transcriere au fost normalizate la media genelor de menaj GAPDH și RPLP0.

Imunoblotarea

Lizatele celulare totale preparate fie în tampon Laemmli, fie RIPA conținând 10 μl/ml inhibitor de protează, 10 μl/ml inhibitor de fosfatază I și 10 μl/ml fosfatază II inhibitor au fost separate electroforetic, transferate cu membrană nitrocelulozică și incubate cu anticorpi care recunosc totalul uman și fosforilat Akt (Ser473), HSL total (# 4107), Ser660 HSL (# 4126) și ATGL (# 2138, toate de la Cell Signaling Technology, Beverley, MA, SUA), identificarea comparativă a genei 58 (CGI-58) # # H00051099- M01, Abnova, Tapei, China), PLIN2 (# PA5-25042) și PLIN3 (# PA5-20272, Thermo Scientific, Franța), fibre musculare lente cu miozină (MAB1628, Millipore Billerica, MA, SUA), cocktail OXPHOS WB anticorp total (# 110411, Abcam), alfa-tubulină iepure (# 2144), GAPDH (# 5174) și β-actină (# 4970, toate de la Cell Signaling Technology). Benzile imunoreactive au fost vizualizate cu chimioluminiscență îmbunătățită (Chemidoc XRS, BioRad) și cuantificate cu software-ul Gel-Pro Analyzer (versiunea 2.0). Anticorpii împotriva GAPDH, alfa-tubulinei sau β-actinei au fost folosiți pentru a normaliza semnalul proteină-anticorp.

Prezentarea datelor și statisticilor

Au fost efectuate teste t Student cu două cozi nepereche pentru a determina diferența dintre grupurile de donatori (GraphPad Prism 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA). Pentru studiile de corelație, s-a efectuat analiza de corelație Spearman, iar coeficientul Spearman, ρ, definește puterea corelației (GraphPad Prism). Analiza modelului mixt liniar (LMM, SPSS 20.0.0.1, IBM SPSS Inc., Chicago, IL, SUA) a fost utilizată pentru a compara donatorii în timpul acumulării acizilor grași și în experimentele de lipoliză (SPA). Valorile sunt raportate ca mijloace ± SEM dacă nu se specifică altfel. Valoarea n reprezintă numărul de donatori diferiți folosiți fiecare cu cel puțin probe duplicate. P Tabelul 1. Caracteristicile donatorului pentru grupul donator cu obezitate severă non-diabetici (nD) și cu obezitate severă cu diabet de tip 2 (T2D).

Miotuburile in vitro își mențin fenotipul in vivo

Pentru a confirma că miotuburile și-au menținut fenotipul diabetic în cultură, s-au măsurat absorbția glucozei stimulată de insulină și fosforilarea Akt (Ser473). Fosforilarea stimulată de insulină a Akt a avut tendința de a fi mai mică în miotuburile de la donatorii cu obezitate severă cu diabet de tip 2 comparativ cu donatorii cu obezitate severă cu toleranță normală la glucoză (Fig. 1A, p = 0,11). Absorbția glucozei stimulată de insulină a fost abolită în miotuburile de la diabetici de tip 2 comparativ cu celulele de la non-diabetici (Fig. 1B, p = 0,01), ceea ce implică o rezistență conservată la insulină în celulele cultivate.

(A) Imagistica în direct a picăturilor de lipide și a conținutului total de lipide neutre în miotuburi de la donatori non-diabetici cu obezitate severă (nD) și donatori cu obezitate severă cu diabet de tip 2 (T2D). Celulele au fost incubate timp de 15 minute cu Hoechst 33258 pentru colorarea nucleelor ​​și Bodipy 493/503 pentru colorarea lipidelor neutre, n = 5. (B) [14 C] OA acumularea peste 0-24 ore. n = 5-6. (C) Distribuția lipidelor măsurată ca încorporare a [14 C] OA în TAG, FFA, DAG, CE și PL. Datele sunt prezentate ca% din totalul lipidelor din celulă, n = 5. (D) Conținutul celular total al activității TAG și TAG hidrolazei (TAGH) în miotuburile non-diabetice și diabetice de tip 2 după 24 de ore de incubație cu 100 μM OA. Conținutul celular total de TAG a fost de 1,4 ± 0,2 nmol/mg proteină (T2D) și 3,0 ± 0,6 nmol/mg proteină (nD). TAGH a fost de 3,7 ± 0,3 nmol mg proteină -1 h -1 (T2D) și 4,1 ± 0,8 nmol mg proteină -1 h -1 (nD) Datele sunt prezentate în raport cu valorile medii ale non-diabeticilor, n = 6-7 . * p Fig 3. Rată mai mare de lipoliză la miotuburi de la donatori cu obezitate severă cu diabet de tip 2.

(A) Lipoliza totală (cu triacsin C) după 24 ore de incubație cu [14 C] OA în miotuburile diabetice nediabetice (nD) și de tip 2 (T2D) n = 5-6. (B) Nivelurile de glucoză plasmatică la jeun s-au corelat pozitiv cu rata lipolizei totale, n = 11 (C) expresie mARN a lipazei hormon-sensibile (HSL), triglicerid lipazei adipoase (ATGL), perilipin 2 (PLIN2), perilipin 3 (PLIN3) și transportorul de acizi grași CD36. Datele sunt prezentate în raport cu valorile medii ale non-diabeticilor, n = 6-10. (D-E) Expresia proteinei HSL, ATGL, identificarea comparativă a genei 58 (CGI-58), PLIN2 și PLIN3 și fosforilarea HSL la serina 660 (HSL Ser660) după 24 ore de incubație cu 100 μM OA. (D) Sunt prezentate două pete reprezentative. Datele sunt prezentate în raport cu valorile medii ale non-diabeticilor, n = 5.

Colorare mitocondrială redusă, dar oxidarea substratului neschimbată

Colorarea mitocondrială cu 40% mai mică, măsurată ca intensitate MitoTrackerRed, a fost observată la diabetul de tip 2 comparativ cu miotuburile non-diabetice (Fig. 4A, B, p = 0,03). Glucoza și oxidarea OA (Fig. 4C, p = 0,5, p = 0,93, respectiv) nu au fost statistic diferite între grupuri, nici OA și absorbția glucozei, nici oxidarea OA incompletă (ASM) (S1 Fig.). Mai mult, expresiile celor două proteine ​​OXPHOS, unitatea ATP sintază și subunitatea Complex I NDUFB8, nu au diferit semnificativ nici între grupuri (p = 0,058 și, respectiv, p = 0,14, Fig. 4D, E). Nu am reușit să detectăm subunitatea Complex II 30 kDa, subunitatea Complex III Core 2 și Complex IV subunitatea 2 a complexului proteic OXPHOS. Provocarea celulelor cu decuplatorul mitocondrial FCCP (cianură de carbonil 4-trifluorometoxi fenilhidrazonă, 1 μM) sau concentrații mai mari de OA (600 μM) nu au evidențiat nicio diferență suplimentară între grupuri (datele nu sunt prezentate). Mai mult, nu au existat diferențe între grupurile în expresia ARNm a genelor esențiale în metabolismul energetic, de ex. carnitina palmitoiltransferază 1B (CPT1B), piruvat dehidrogenază kinază izozima 4 (PDK4), receptorul activat cu proliferator peroxizom gamma coactivator-1 alfa (PPARGC1A) și citocromul C-1 (CYC1) (datele nu sunt prezentate).

Miotuburile de la donatori non-diabetici cu obezitate severă (nD) și donatorii cu obezitate severă cu diabet de tip 2 (T2D) au fost colorate cu MitoTrackerRed (mitocondrii) și Hoechst 33258 (nuclei). (A) Imagini reprezentative după incubare de 24 de ore cu 100 µM acid oleic (OA). Albastrul este nucleu și roșu este mitocondria. Mărirea este 1:20, bara de scară reprezintă 50 μm. (B) Colorarea mitocondrială legată de numărul de nuclei la 100 0000 UA. Miotuburile au fost incubate cu sau fără 100 µM acid oleic (OA). Media ± SEM sunt prezentate legate de numărul de nuclee, n = 5, * p 14 C] OA (18,5 kBq, 100 μM) sau [14 C] glucoză (18,5 kBq, 200 μM) timp de 4h. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM, n = 7. UA, unități arbitrare. (D-E) Expresii proteice ale subunității ATP sintază și ale subunității Complex I NDUFB8. Probele de proteine ​​au fost recoltate și analizate așa cum este descris în Materiale și metode, iar nivelurile de expresie au fost normalizate la alfa-tubulină. (D) Western blots reprezentative dintr-un experiment. (E) Expresiile proteice ale subunității ATP sintază și ale subunității Complex I NDUFB8 legate de alfa-tubulină. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM, n = 5-8.

Flexibilitate metabolică

Parametrii de flexibilitate metabolică au fost determinați așa cum s-a descris mai înainte [5], iar miotuburile derivate de la diabetici de tip 2 au arătat o adaptabilitate cu oxidare OA cu 30% mai mică decât miotuburile de la non-diabetici, în timp ce parametrii de flexibilitate și supresibilitate reglați de substrat nu au fost semnificativ diferiți (Fig. 5, p = 0,02, p = 0,26, respectiv p = 0,45).