Subiecte

Abstract

Sindromul respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2) este cauza bolii coronavirusului 2019 (COVID-19), care a devenit o urgență de sănătate publică de interes internațional 1. Enzima de conversie a angiotensinei 2 (ACE2) este receptorul de intrare celulară pentru coronavirusul sindromului respirator acut sever (SARS-CoV) 2. Aici am infectat șoareci transgenici care exprimă ACE2 uman (în continuare, șoareci hACE2) cu SARS-CoV-2 și am studiat patogenitatea virusului. Am observat pierderea în greutate, precum și replicarea virusului în plămânii șoarecilor hACE2 infectați cu SARS-CoV-2. Histopatologia tipică a fost pneumonia interstițială cu infiltrarea unui număr considerabil de macrofage și limfocite în interstițiul alveolar și acumularea de macrofage în cavitățile alveolare. Am observat antigeni virali în celulele epiteliale bronșice, macrofage și epitelii alveolare. Aceste fenomene nu au fost găsite la șoareci de tip sălbatic infectați cu SARS-CoV-2. În special, am confirmat patogenitatea SARS-CoV-2 la șoareci hACE2. Acest model de șoarece al infecției cu SARS-CoV-2 va fi valoros pentru evaluarea agenților terapeutici antivirali și a vaccinurilor, precum și pentru înțelegerea patogeniei COVID-19.

La sfârșitul lunii decembrie 2019, cazuri de COVID-19 - care este cauzat de SARS-CoV-2 - au fost identificate și raportate din orașul Wuhan (provincia Hubei, China), unde au fost legate de o piață de fructe de mare la care au fost vândute și animale exotice. și a consumat 1.3. Numărul cazurilor confirmate a crescut de atunci: începând cu 25 februarie 2020, aproape 78.000 de cazuri și peste 2.700 de decese au fost raportate în China 4, iar cazurile importate de la călătorii din China continentală au fost raportate în alte câteva țări. Este esențial să se stabilească patogenitatea și biologia virusului pentru prevenirea și tratamentul bolii.

Deoarece SARS-CoV-2 este foarte omolog cu SARS-CoV, ACE2 uman - care este receptorul de intrare al SARS-CoV - a fost, de asemenea, considerat a avea o capacitate mare de legare cu SARS-CoV-2 prin analiza biologică moleculară 2.5. Prin urmare, am folosit șoareci transgenici hACE2 și șoareci de tip sălbatic infectați cu tulpina HB-01 a SARS-CoV-2 pentru a studia patogenitatea virusului.

Tip sălbatic masculin și feminin fără patogeni specifici (n = 15) sau hACE2n = 19) șoareci cu vârsta cuprinsă între 6 și 11 luni au fost inoculați intranasal cu tulpina SARS-CoV-2 HB-01 la o doză de 10 5 50% doză infecțioasă de cultură tisulară (TCID50) per 50 μl volum de inocul per șoarece, după șoareci au fost anesteziate intraperitoneal folosind 2,5% avertină; șoareci hACE2 tratați în mod fals (n = 15) au fost utilizate ca control. Manifestările clinice au fost înregistrate de la 13 șoareci (3 șoareci de tip sălbatic infectați cu HB-01; 3 șoareci hACE2 tratați în mod fals; și 7 șoareci hACE2 infectați cu HB-01). Am observat o ușoară blană cu păr și o pierdere în greutate numai la șoarecii hACE2 infectați cu HB-01 - și nu la șoarecii de tip sălbatic infectați cu HB-01 sau șoarecii hACE2 tratați în mod fals - în timpul celor 14 zile de observare; alte simptome clinice, cum ar fi spatele arcuit și răspunsul scăzut al stimulilor externi, nu au fost găsite la niciunul dintre șoareci. În special, pierderea în greutate a șoarecilor hACE2 infectați cu HB-01 a fost de până la 8% la 5 zile după infecție (dpi) (Fig. 1a).

patogenitatea

În plus, am demonstrat colocalizarea proteinei SARS-CoV-2 S (Fig. 3f) și a receptorului ACE2 uman (Fig. 3g) în celulele epiteliale alveolare ale șoarecilor hACE2 infectați cu HB-01 folosind imunofluorescență, la 3 dpi 3h) . Acest fenomen nu a fost găsit la șoarecii hACE2 tratați în mod fals (Fig. 3a - d) sau la șoarecii de tip sălbatic infectați cu HB-01 (datele nu sunt prezentate), ceea ce indică faptul că SARS-CoV-2 - ca și în cazul SARS-CoV - utilizează ACE2 uman ca receptor pentru intrarea 5 .

Colocalizarea proteinei SARS-CoV-2 S și a receptorului ACE2 uman în plămânii șoarecilor hACE2. Secțiunile au fost incubate cu anticorp anti-SARS-CoV-2 S, anticorp anti-uman ACE2 și DAPI. A-d, Secțiuni pulmonare ale șoarecilor hACE2 tratați în mod fals. e-h, Secțiuni pulmonare ale șoarecilor hACE2 infectați cu HB-01. Săgețile albe arată proteina S virală (f) și ACE2 uman (g); săgețile galbene arată îmbinarea proteinei S virale cu ACE2 umană (h). Bare de scară, 25 μm. Date în A-h sunt reprezentative pentru trei experimente independente.

Viteza răspândirii geografice a COVID-19 a dus la declararea bolii ca o urgență de sănătate publică de interes internațional, cazurile raportate pe mai multe continente la doar câteva săptămâni după ce boala a fost raportată pentru prima dată 6. Deși a fost stabilit de bioinformatică că agentul patogen care cauzează această epidemie este un coronavirus nou, este necesar ca acest lucru să fie confirmat de experimente pe animale (urmând postulatele lui Koch) 7. Studiile clinice anterioare au confirmat izolarea virusului de gazde cu boala și cultivarea în celulele gazdă 1. Aici arătăm că, după infecția experimentală a șoarecilor hACE2 cu unul dintre cele mai vechi izolate cunoscute ale SARS-CoV-2, modelul nostru de șoarece al infecției cu SARS-CoV-2 prezintă replicare virală în plămâni caracterizată prin pneumonie interstițială moderată - similar cu rapoarte clinice inițiale de pneumonie cauzată de SARS-CoV-2 8. Mai mult, am observat, de asemenea, anticorpi specifici împotriva SARS-CoV-2 și am re-izolat virusul de la șoareci infectați.

Rata mortalității cazurilor raportate în prezent de COVID-19 este de aproximativ 2%, ceea ce implică faptul că - până în prezent - SARS-CoV-2 nu pare să provoace ratele ridicate de fatalitate observate pentru SARS-CoV (9-11%) 9; acest lucru sugerează că există diferențe de patogenitate între cei doi viruși. La șoareci, patogenitatea SARS-CoV-2 pare ușoară în comparație cu SARS-CoV; acesta din urmă provoacă leziuni ale organelor extrapulmonare (inclusiv creierul, rinichii, intestinul, inima și ficatul) și, în plus, neuronii sunt susceptibili la infecție cu SARS-CoV - s-au observat vasculită cerebrală și hemoragii la șoareci hACE2 infectați cu SARS-CoV 10,11 . Cu toate acestea, la șoarecii hACE2 infectați cu SARS-CoV-2 s-a observat doar pneumonie interstițială, ceea ce implică o diferență de patogenitate între cele două coronavirusuri.

Rezultatele noastre demonstrează patogenitatea SARS-CoV-2 la șoareci, care - împreună cu studiile clinice anterioare 1 - satisface complet postulatele lui Koch 7 și confirmă faptul că SARS-CoV-2 este agentul patogen responsabil pentru COVID-19. Modelul nostru de șoarece de infecție cu SARS-CoV-2 va fi valoros pentru evaluarea agenților terapeutici antivirali și a vaccinurilor, precum și pentru înțelegerea patogeniei acestei boli.Notă adăugată în dovadă: În versiunea acestei lucrări care a fost publicată inițial online, Fig. 2a conținea o duplicare. În versiunea figurii care a fost publicată inițial, au fost prezentate secțiuni de țesut dintr-un eșantion WT + HB-01 în loc de secțiuni de țesut din simularea ACE2 +. Figura publicată inițial poate fi găsită aici ca Fig suplimentară. 1.

Metode

Nu s-au utilizat metode statistice pentru a determina dimensiunea eșantionului. Experimentele nu au fost randomizate, iar anchetatorii nu au fost orbi de alocare în timpul experimentelor și evaluării rezultatelor.

Declarație de etică

Studiile la șoareci au fost efectuate într-o instalație de biosecuritate de nivel 3 (ABSL3), utilizând izolatoare filtrate HEPA. Toate procedurile din acest studiu care implică șoareci au fost revizuite și aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Institutul de științe animale de laborator, Colegiul Medical al Uniunii din Beijing (BLL20001). Toate experimentele au respectat toate reglementările etice relevante.

Viruși și celule

Tulpina SARS-CoV-2 HB-01 a fost furnizată de W. Tan 1. Genomul complet pentru acest SARS-CoV-2 a fost trimis la GISAID (identificator: BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2020 | EPI_ISL_402119) și depus în Centrul Național de Date Microbiologice din China (numărul de acces NMDC10013001 și numărul de acces al genomului MDC60013002-01). Stocurile de semințe SARS-CoV-2 și studii de izolare a virusului au fost efectuate în celulele Vero, care au fost menținute în mediul Eagle modificat (DMEM) (Invitrogen) Dulbecco suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS), 100 UI/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină și incubat la 37 ° C, 5% CO2. Pentru șoarecii infectați, omogenatele pulmonare au fost utilizate pentru testele de titrare a virusului utilizând titrarea punctului final în celulele Vero E6. Titrurile de virus ale supernatantului au fost determinate folosind un test TCID50 standard.

Experimente cu șoareci

Pentru experimentele cu șoareci, șoareci hACE2 masculi și femele, fără patogeni specifici, de 6-11 luni, au fost obținuți de la Institutul de Științe Animale de Laborator, Colegiul Medical al Uniunii din Beijing. Șoarecii transgenici au fost generați prin microinjecția șoarecelui Ace2 promotor care conduce omul ACE2 secvența de codificare în pronuclei de ovule fertilizate de la șoareci ICR, iar apoi ACE2 uman integrat a fost identificat prin PCR așa cum s-a descris anterior 10; ACE2 uman exprimat în principal în plămâni, inimă, rinichi și intestine de șoareci transgenici. După anestezierea intraperitoneală cu 2,5% avertină cu 0,02 ml/g greutate corporală, șoarecii hACE2 sau de tip sălbatic (ICR) au fost inoculați intranazal cu virusul stoc SARS-CoV-2 la o doză de 105 TCID50 și șoareci hACE2 inoculați intranazal cu un volum egal de PBS au fost utilizate ca control al infecției simulate. Șoarecii infectați au fost observați continuu pentru a înregistra greutatea corporală, simptomele clinice, răspunsurile la stimuli externi și moartea. Șoarecii au fost disecați la 1, 3, 5 și 7 dpi pentru a colecta diferite țesuturi pentru a examina replicarea virusului și modificările histopatologice.

Prepararea supernatantului omogenizat

Omogenizările de țesuturi (1 g/ml) au fost preparate prin omogenizarea țesuturilor perfuzate folosind un omogenizator electric timp de 2 min 30 s în DMEM. Omogenatele au fost centrifugate la 3.000 rpm timp de 10 minute la 4 ° C. Supernatantul a fost colectat și depozitat la -80 ° C pentru detectarea titrului viral și a încărcăturii virale.

Extracția ARN și RT - qPCR

Metoda ELISA

IgG specific împotriva SARS-CoV-2 de la șoareci hACE2 și de tip sălbatic infectați cu HB-01 a fost determinat de ELISA. Nouăzeci și șase de plăci au fost acoperite cu proteina Spike 1 (S1) a SARS-CoV-2 (0,1 μg/100 μl, Sino Biological, 40591-V08H), serurile testate au fost diluate la 1: 100 și adăugate la fiecare bine, și s-au setat 3 godeuri multiple pentru fiecare probă, apoi s-au incubat la 37 ° C timp de 30 de minute, urmate de anticorpi anti-șoarece de capră conjugați cu HRP (ZB-2305, zhongshan, diluție 1: 10.000) și incubate temperatura camerei timp de 30 min. Reacția a fost dezvoltată de substratul TMB și s-au determinat densitățile optice la 450 nm (marker enzimatic Metertech960 cu lungimea de undă de 450 nm).

Pregătirea în laborator a anticorpului proteinei SARS-CoV-2 S1

Șoarecii au fost imunizați cu proteină SARS-CoV-2 S1 purificată (Sino biologic) și splenocitele șoarecilor hiperimunizați au fost fuzionați cu celule de mielom. Clonele pozitive au fost selectate de ELISA folosind proteina SARS-CoV-2 S1 (date extinse Fig. 5). Supernatantul celular al clonei 7D2, care se leagă de proteina SARS-CoV-2 S1, a fost colectat pentru analiza imunofluorescenței.

Examen patologic

Autopsiile au fost efectuate într-un laborator de biosecuritate de nivel 3 (ABSL3). Organele majore au fost examinate grosolan și apoi fixate în soluție de formalină tamponată 10%, iar secțiunile de parafină (cu grosime de 3-4 μm) au fost pregătite în mod obișnuit. Hematoxilină și eozină, acid periodic - petele Schiff și modificate ale tricromului Masson au fost utilizate pentru a identifica modificările histopatologice în toate organele. Histopatologia țesutului pulmonar a fost observată prin microscopie cu lumină.

Microscopie confocală

Microscopie electronică de transmisie

Supernatantul din culturile de celule Vero E6 care au prezentat efecte citopatice a fost colectat, inactivat cu paraformaldehidă 2% timp de cel puțin 2 ore și ultracentrifugat pentru a sedimenta particule de virus. Supernatantul îmbogățit a fost colorat negativ pe grile acoperite cu film pentru examinare. Grilele colorate negativ au fost observate prin transmisie prin microscopie electronică.

analize statistice

Toate datele au fost analizate cu software-ul GraphPad Prism 8.0. Diferențele semnificative statistic au fost determinate folosind nepereche t-teste, Student’s t-teste, Welch’s t-teste sau Mann - Whitney U-teste, după caz ​​și conform cerințelor de testare. O față-verso P valoare

Disponibilitatea datelor

Toate datele brute sunt disponibile de la autorii relevanți la cerere rezonabilă. Datele sursă sunt furnizate împreună cu această lucrare.

Referințe

Zhu, N. și colab. Un nou coronavirus de la pacienții cu pneumonie din China, 2019. N. Engl. J. Med. 382, 727–733 (2020).

Cuba, K. și colab. Un rol crucial al enzimei de conversie a angiotensinei 2 (ACE2) în leziunea pulmonară indusă de coronavirus SARS. Nat. Med. 11, 875–879 (2005).

Ren, L. L. și colab. Identificarea unui nou coronavirus care cauzează pneumonie severă la om: un studiu descriptiv. Bărbie. Med. J. (engleză) 133, 1015-1024 (2020).

Comisia Națională de Sănătate din China. Actualizare privind noul focar de pneumonie cu coronavirus (24 ianuarie 2020)). http://www.nhc.gov.cn/yjb/s7860/202002/84faf71e096446fdb1ae44939ba5c528.shtml (China National Health Commission, 2020).

Xu, X. și colab. Evoluția noului coronavirus de la focarul în curs de desfășurare de la Wuhan și modelarea proteinei sale spike pentru riscul de transmitere umană. Știință. China Life Sci. 63, 457–460 (2020).

Chan, J. F. și colab. Un grup familial de pneumonie asociat cu noul coronavirus din 2019 care indică transmiterea de la persoană la persoană: un studiu al unui grup familial. Lancet 395, 514–523 (2020).

Rivers, T. M. Viruses și postulatele lui Koch. J. Bacteriol. 33, 1-12 (1937).

Huang, C. și colab. Caracteristici clinice ale pacienților infectați cu coronavirusul nou din 2019 în Wuhan, China. Lancet 395, 497–506 (2020).

de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D. & Munster, V. J. SARS și MERS: perspective recente asupra coronavirusurilor emergente. Nat. Rev. Microbiol. 14, 523–534 (2016).

Yang, X. H. și colab. Șoarecii transgenici pentru enzima 2 de conversie a angiotensinei umane oferă un model pentru infecția cu coronavirus SARS. Comp. Med. 57, 450–459 (2007).

Netland, J., Meyerholz, D. K., Moore, S., Cassell, M. și Perlman, S. Sindromul respirator acut sever Infecția cu coronavirus cauzează moartea neuronală în absența encefalitei la șoareci transgenici pentru ACE2 uman. J. Virol. 82, 7264–7275 (2008).

Mulțumiri

Mulțumim lui G. F. Gao pentru sfaturile și coordonarea sa cu privire la această lucrare; H. Deng, X. Yang și L. Zhang pentru că au oferit cadouri șoarecilor hACE2; și G. Wong pentru că ne-a ajutat să corectăm manuscrisul. Această lucrare a fost susținută de Proiectul național de cercetare și dezvoltare al Chinei (2020YFC0841100), Fondurile fundamentale de cercetare pentru CAMS din China (2020HY320001), Proiectul național de cercetare și dezvoltare al Chinei (2016YFD0500304), inițiativa CAMS pentru medicina inovatoare din China (2016-I2M -2-006) și Mega-proiecte naționale din China pentru boli infecțioase majore (2017ZX10304402, 2018ZX10301403).

Informatia autorului

Acești autori au contribuit în mod egal: Linlin Bao, Wei Deng, Baoying Huang, Hong Gao, Jiangning Liu

Afilieri

Laboratorul cheie de la Beijing pentru modele animale de boli infecțioase emergente și remergente, Institutul de științe animale de laborator, Academia Chineză de Științe Medicale, Beijing, China

Linlin Bao, Wei Deng, Hong Gao, Jiangning Liu, Qiang Wei, Pin Yu, Yanfeng Xu, Feifei Qi, Yajin Qu, Fengdi Li, Qi Lv, Jing Xue, Shuran Gong, Mingya Liu, Guanpeng Wang, Shunyi Wang, Zhiqi Song, Linna Zhao, Haisheng Yu, Xiaojuan Zhang și Chuan Qin

Laboratorul cheie NHC de medicină comparativă a bolilor umane, Centrul de medicină comparată, Colegiul Medical din Uniunea Beijing, Beijing, China

Linlin Bao, Wei Deng, Hong Gao, Jiangning Liu, Qiang Wei, Pin Yu, Yanfeng Xu, Feifei Qi, Yajin Qu, Fengdi Li, Qi Lv, Jing Xue, Shuran Gong, Mingya Liu, Guanpeng Wang, Shunyi Wang, Zhiqi Song, Linna Zhao, Haisheng Yu, Xiaojuan Zhang și Chuan Qin

Laboratorul cheie MHC de biosecuritate, Institutul Național pentru Controlul și Prevenirea Bolilor Virale, China CDC, Beijing, China

Baoying Huang, Wenling Wang, Peipei Liu, Li Zhao, Fei Ye, Huijuan Wang, Weimin Zhou, Na Zhu, Wei Zhen, Jun Han, Wenbo Xu, Wenjie Tan și Guizhen Wu

Institutul de Biologie Patogenă, Academia Chineză de Științe Medicale, Beijing, China

Lili Ren, Li Guo, Lan Chen, Conghui Wang, Ying Wang, Xinming Wang, Yan Xiao și Qi Jin

Institutul de Biologie Medicală, Academia Chineză de Științe Medicale, Beijing, China

Qiangming Sun, Hongqi Liu, Fanli Zhu, Chunxia Ma, Lingmei Yan, Mengli Yang și Xiaozhong Peng

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar