• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Record ORCID pentru Jennifer L. Estall
  • Pentru corespondență: [email protected]

Editat de Marc Montminy, Institutul Salk pentru Studii Biologice, La Jolla, CA și aprobat la 18 ianuarie 2019 (primit pentru revizuire 2 septembrie 2018)

reglează

Semnificaţie

Ficatul joacă roluri cruciale în controlul homeostaziei glucozei în timpul ciclului de hrănire rapidă. Răspunde la insulină și glucagon fie pentru a stoca, fie pentru a furniza glucoză altor organe. Rezistența la insulină este un semn distinctiv al bolilor metabolice, cum ar fi diabetul de tip 2 și bolile hepatice grase nealcoolice. S-au făcut asocieri între nivelurile hepatice scăzute ale receptorului activat cu proliferatorul peroxizomului gamma coactivator 1-alfa (PGC1A) și rezistența la insulină hepatică, dar mecanismele de bază sunt evazive. Arătăm că PGC1A controlează raportul hepatic dintre substraturile receptorului de insulină 1 (IRS1) și expresia IRS2, esențiale pentru definirea semnalului precis de insulină în hepatocite pentru a răspunde la post și hrănire. Important, PGC1A este cheia pentru suprimarea mediată de insulină a producției hepatice de glucoză.

Abstract

Coactivatorul gamma 1 alfa al receptorului activat cu proliferator de peroxizom (PGC1A) este un coactivator transcripțional dintr-o familie care include alți doi membri, receptorul activat al proliferatorului peroxizomului, gamma coactivator 1-beta (PGC1B) și receptorul activat al proliferatorului peroxizomului, receptor al co-activatorului proteinei gamma 1 (PPRC1), care leagă factorii de transcripție pentru a spori expresia mai multor gene implicate în metabolismul nutrienților (4). PGC1A reglează răspunsul hepatic la post prin promovarea gluconeogenezei (5), catabolismului lipidic (6) și detoxifierii speciilor reactive de oxigen produse de mitocondrii (7). Reducerile expresiei PGC1A sunt asociate cu rezistența la insulină hepatică în diabet și NAFLD la om (8 ⇓ –10). Modelele de șoareci sugerează că reducerile fiziologice ale PGC1A perturbă semnalizarea insulinei în ficat (6, 7), iar șoarecii cu PGC1A hepatic scăzut sunt mai sensibili la steatoza hepatică și hipertrigliceridemie, semnele distinctive ale rezistenței la insulină (6, 11, 12).

Până acum, nu era clar dacă modificările sensibilității la insulină hepatică legate de activitatea PGC1A se datorează efectelor asupra metabolismului mitocondrial și/sau al acizilor grași care măresc acumularea de lipide și deteriorarea oxidativă (6, 7, 11 ⇓ ⇓ –14) sau reglarea directă a genelor care controlează calea de semnalizare a insulinei (15). Folosind modele de câștig și pierdere a funcției în hepatocitele primare de șoarece, arătăm că PGC1A reglează expresia multor componente din amonte ale căii de semnalizare a insulinei în hepatocite, mai ales nivelurile IRS. Arătăm că PGC1A influențează echilibrul dintre expresia IRS1 și IRS2 în celulele hepatice și, ca rezultat, coactivatorul joacă un rol cheie în controlul gluconeogenezei mediat de insulină în timpul tranziției post-alimentat.

Rezultate

Nivelurile PGC1A influențează fosforilarea AKT stimulată de insulină.

Datele conflictuale din diferite modele de pierdere a funcției au înțeles complicat dacă PGC1A inhibă sau activează semnalizarea insulinei în ficat (6, 7, 15). Pentru a aborda această întrebare, am evaluat mai multe aspecte ale căii de semnalizare a insulinei utilizând studii de câștig și pierdere a funcției în hepatocitele primare de șoarece. Paradoxal, atât eliminarea completă, cât și supraexprimarea PGC1A au crescut fosforilarea AKT S473 ca răspuns la insulină (Fig. 1 A și B). Creșterile fosforilării AKT nu s-au datorat creșterilor compensatorii ale PGC1B (7), deoarece fosforilarea AKT indusă de insulină a crescut în mod similar la hepatocitele șoarecilor lipsiți de ambii coactivatori (dublu knockout LA/BKO) (Fig. 1C și SI Anexa, Fig. S1A ). Diferențele în fosforilarea AKT nu au fost, de asemenea, datorate semnalizării sporite a receptorului de insulină, deoarece nivelurile de proteine ​​ale receptorului de insulină și fosforilarea indusă de ligand (Y1146) nu au fost afectate de pierderea PGC1A (Fig. 1D). Supraexprimarea PGC1A a dus la scăderea fosforilării receptorului de insulină ca răspuns la insulină, în ciuda nivelurilor sporite de p-Akt S473 și p-AKT T308 (Fig. 1 B și E). Astfel, în timp ce aceste date au confirmat PGC1A ca un modulator important al semnalizării insulinei hepatice, rezultatele nu au fost ușor de explicat prin legăturile descrise anterior între PGC1A și acțiunea insulinei (7, 15).

Nivelurile PGC1A influențează fosforilarea AKT stimulată de insulină. Imunoblote de proteine ​​din hepatocite primare de șoarece tratate cu insulină 100 nM timp de 15 minute (sau timpul indicat). Activarea căii de semnalizare a insulinei în hepatocite de la șoareci (A și D) masculi WT și LH (heterozigot hepatic-PGC1A) și LKO (knockout hepatic-PGC1A). (B și E) Hepatocite infectate cu adenovirusuri care exprimă controlul vectorului (AdCTL) sau PGC1A sau (C) șoareci PGC1A și PGC1B dublu-hepatici specifici ficatului (LA/BKO). Toate experimentele au fost efectuate de cel puțin două ori și fiecare bandă reprezintă un mouse individual.

Nivelurile PGC1A afectează expresia genetică a jucătorilor cheie de semnalizare a insulinei.

Deoarece diferite proteine ​​pot regla direct sau indirect fosforilarea AKT ca răspuns la insulină (2), am emis ipoteza că, ca coactivator transcripțional, PGC1A ar putea controla diferențial expresia unuia sau mai multor dintre acești intermediari. Supraexprimarea PGC1A în hepatocitele primare a crescut semnificativ expresia Insr, Irs2, Mtor, Rictor, Raptor și Rheb, în ​​timp ce scade Irs1, Pi3kr1 și Deptor (Fig. 2A). Așa cum era de așteptat, modificarea PGC1A/B a modificat nivelurile de ARNm ale genelor care controlează procesele mitocondriale (Anexa SI, Fig. S1 B și C). Supraexprimarea PGC1B a avut efecte similare asupra căii de semnalizare a insulinei, cu excepția nivelurilor de Insr, Rictor și Deptor care au fost neschimbate (Fig. 2B). Modelul reciproc al expresiei Irs a fost observat în hepatocitele dublu KO PGC1A/B, cu Irs1 crescut semnificativ și Irs2 scăzut (Fig. 2C), în timp ce Pi3kr1 și Rheb au fost în mod similar scăzute fie prin pierderea, fie prin câștigul expresiei PGC1.

Nivelurile PGC1A afectează expresia genelor membrilor cheie ai căii de semnalizare a insulinei. Exprimarea genei prin qPCR în hepatocitele primare de șoarece. Celule WT infectate cu adenovirus care supraexprimă (A) PGC1A, (B) PGC1B sau (C) hepatocite primare izolate de la șoareci LA/BKO. Experimentele au fost efectuate cel puțin de două ori cu n = 4 ± SEM * P S473 ca răspuns la insulină (17) (apendicele SI, fig. S3), explicând potențial de ce s-a observat supraactivarea AKT atât după supraexprimare (fig. 1B), cât și prin eliminarea Fig. .1 A și C și 3B) din PGC1A.

PGC1A reglează expresia proteinei IRS. Imunoblote de proteine ​​din hepatocite primare tratate timp de 15 minute cu insulină 100 nM. (A) Celulele care supraexprimă controlul vectorului (CTL), PGC1A sau PGC1B. (B) Celule de la șoareci LA/BKO. (C) Raportul p-AKT la t-AKT în celulele care supraexprimă PGC1A sau PGC1B (n = 4 ± SEM, efectuate de cel puțin două ori).

PGC1A potențează expresia IRS2 stimulată de glucagon prin proteina de legare a elementului de răspuns cAMP.

PGC1A potențează expresia IRS2 stimulată de glucagon prin CREB. Hepatocite primare de șoarece tratate cu glucagon sau vehicul de 40 nM. (A) Expresia genei (n = 4 ± SE) și (B) imunobloti din celule care exprimă shControl sau shPGC1A. (B, dreapta) Cuantificarea a două experimente (n = 5 ± SEM). (C) Imunoblot de hepatocite care exprimă controlul vectorului (CTL) sau CREB dominant-negativ (C-DN sau CREBDN), TCF4 dominant-negativ (T-DN sau TCF4DN) sau PGC1A, după cum este indicat. (Dreapta) Cuantificarea a două experimente (n = 5 ± SEM). (D) mARN în hepatocite primare care exprimă DN CREB sau vectorul de control. (E) Imunobloti din hepatocite primare pretratate sau nu cu glucagon (40 nM, 4 h) și tratate cu insulină (100 nM, 15 min). * P 2 = 0,61, P 2 = 0,58, P 2 = 0,26, respectiv P = 0,01). Nivelurile IRS1 nu s-au corelat semnificativ cu expresia oricăruia dintre acești factori de transcripție (SI Anexa, Fig. S5). Deși am observat o corelație pozitivă între Epas1 și Irs2, nivelurile Epas1 (HIF2A) în ficat cresc postprandial pentru a reprima acțiunea glucagonului (29), un interval de timp în care PGC1A și IRS2 sunt cele mai mici (17, 30). Astfel, ne-am concentrat atenția asupra TCF4 și CREB ca potențiali parteneri ai PGC1A în potențarea expresiei IRS2.

Pentru a determina dacă TCF4 sau CREB au fost necesare pentru axa glucagon/PGC1A/IRS2, am evaluat capacitatea glucagonului și PGC1A de a induce IRS2 în prezența TCF4 dominant-negativ (31) sau CREB (21). Nivelurile de proteine ​​IRS2 induse de glucagon și PGC1A nu au fost afectate de expresia TCF4 dominant-negativ, dar au scăzut semnificativ prin inhibarea activității CREB (Fig. 4C), în concordanță cu reducerile expresiei genei Irs2 induse de glucagon prin CREB dominant-negativ ( Fig. 4D). Astfel, controlul expresiei IRS2 de către glucagon și PGC1A a fost dependent de activitatea CREB. Înainte de hrănire, nivelurile de glucagon sunt ridicate și insulina scăzută. În această stare, datele noastre sugerează că activarea axei glucagon/PGC1A schimbă raportul IRS1: IRS2, crescând cantitatea de IRS2 disponibilă pentru receptorul de insulină și amorsând ficatul pentru răspunsul la insulină postprandial. În consecință, când hepatocitele primare au fost pretratate cu glucagon, fosforilarea indusă de insulină a AKT a fost crescută (Fig. 4E).

Suprimarea indusă de insulină a gluconeogenezei hepatice este reglementată de axa PGC1A/IRS2.

Suprimarea indusă de insulină a gluconeogenezei hepatocitelor este reglementată de axa PGC1A/IRS2 in vitro și in vivo. (A) Suprimarea mediată de insulină (100 nM, 1 h) suprimarea gluconeogenezei induse de glucagon (1 nM, 1 h) (GNG) în vectorul hepatocitelor primare care supraexprimă vectorul, IRS1 sau IRS2 (n = 8 ± SEM). * P ⇓ –14). Cu toate acestea, interesul pentru dezvoltarea unor produse terapeutice care cresc PGC1A poate fi temperat de temerile privind creșterea PGC1A în ficat, promovând o producție inadecvată de glucoză. Datele noastre arată că PGC1A modulează mai multe căi în hepatocite pentru a controla producția de glucoză, sugerând că acest rezultat potențial dăunător poate fi nejustificat.

În mod neașteptat, nivelurile modificate ale PGC1A și PGC1B au afectat expresia genei a numeroși membri ai căii mTOR. Deoarece modificările genetice nu s-au reflectat la nivelul proteinelor și am identificat o legătură clară între activitatea coactivatorului PGC1A, expresia IRS și activarea AKT, nu am urmărit dacă modificările expresiei genei mTOR au avut consecințe funcționale pe cale. Cercetările arată că activitatea mTOR afectează în primul rând starea de fosforilare a IRS1 și IRS2, nu nivelul de expresie al acestuia (34, 35). Interesant este că White și colaboratorii (34) arată că, într-o stare alimentată (când PGC1A este scăzută), IRS2 este degradat de o cale dependentă de mTOR. Prin urmare, modificările proteinei DEPTOR (un inhibitor al mTOR) conduse de PGC1A pot reprezenta un mecanism de feedback convenabil pentru a controla degradarea IRS2 în timpul postului. Studii suplimentare sunt justificate pentru a dezlega conexiunile mecaniciste între PGC1A și mTOR, care ar putea fi, de asemenea, complicate de efectele PGC1A asupra metaboliților detectați de AMPK și mTOR (36).

Deși putem specula impactul fiziologic al schimbării raportului IRS1: IRS2, studii suplimentare sunt justificate pentru a descifra funcțiile biologice precise ale acestor efectori ai receptorilor de insulină în hepatocite. Un studiu recent asupra țesutului adipos maro arată că supraexprimarea IRS1 sau IRS2 are rezultate de semnalizare largi și distinctive (39). Studiile anterioare pe șoareci knockout IRS (17, 18, 22, 40, 41) descriu elegant cerința IRS pentru metabolismul energetic al întregului corp în timpul tranziției alimentate la post, dar efectele autonome ale celulelor asupra proceselor metabolice hepatice sunt încă incert. Astfel, în timp ce arătăm o dependență de PGC1A pentru a regla expresia IRS1 și IRS2 în celulele hepatice de șoarece, consecințele precise ale acestuia asupra metabolismului hepatic al glucozei și lipidelor în ansamblu în aval de insulină sunt încă în mare parte necunoscute.

Interesant, am arătat că atât PGC1A, cât și PGC1B scad expresia IRS1, în timp ce doar PGC1A conduce expresia IRS2. Acest lucru evidențiază o distincție funcțională importantă între acești coactivatori legați structural, care împărtășesc multe ținte din aval, dar par să aibă, de asemenea, roluri unice în metabolismul glucozei și lipidelor din jurul ficatului (42). Important, PGC1B se crede că joacă un rol mai semnificativ în lipogeneză (43). Datele noastre care demonstrează că PGC1A și PGC1B au efecte diferențiale asupra modulatorilor cheie ai semnalizării receptorilor de insulină pot ajuta la explicarea diferențelor și la o mai bună înțelegere a impactului acestor coactivatori asupra homeostaziei energiei hepatice. Cu toate acestea, în timp ce arătăm că CREB este important pentru capacitatea PGC1A de a induce IRS2, mecanismul prin care PGC1s scade expresia Irs1 în hepatocite nu a fost încă identificat.

Pe scurt, arătăm că PGC1A reglează reciproc expresia proteinei IRS și mediază inducerea IRS2 ca răspuns la glucagon, ceea ce este important pentru adaptarea hepatică la post și tranziția la starea hrănită. Acest lucru aruncă o nouă lumină asupra impactului PGC1A asupra căii de semnalizare a insulinei și potențial asupra patologiilor care rezultă din neregularitatea transducției IRS-dependente de semnal.

Materiale și metode

Animale.

Șoarecii Kp specifici ficatului condiționat Ppargc1a, Ppargc1b ​​și Ppargc1a f/f: șoarecii Kp Ppargc1b ​​f/f au fost generați și menținuți așa cum s-a descris anterior (7) (Anexa SI, Metode suplimentare). Toate experimentele au fost aprobate și efectuate în conformitate cu regulamentele comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul instituției de cercetări clinice din Montreal.

Izolarea și cultura hepatocitelor primare.

Hepatocitele primare de șoareci de la șoareci masculi și femele în vârstă de 10 până la 12 săptămâni au fost izolate prin purificarea colagenazei perfuzie/gradul percoll și infectate cu adenovirusuri așa cum s-a descris anterior (6). Pentru răspunsurile la insulină sau glucagon, celulele au fost incubate peste noapte în medii cu conținut ridicat de glucoză (25 mM) lipsit de dexametazonă și insulină. S-au adăugat insulină și glucagon la concentrațiile și timpii indicați.

Fenotiparea metabolică in vivo.

Nivelurile de glucoză din sânge și insulină plasmatică au fost măsurate după un repaus peste noapte (16 ore) sau 1 oră după realimentare. Pentru a testa toleranța piruvatului, piruvatul de sodiu (2 mg/kg) a fost injectat intraperitoneal după un post peste noapte, iar glicemia a fost măsurată la momentele indicate. Pentru supraexprimare, șoarecii masculi au fost coada-vena - injectați cu un vector care exprimă adenovirus (martor) sau ADNc PGC1A (2 × 10 9 unități infecțioase) cu recuperare timp de 1 săptămână înainte de testare.

Suprimarea gluconeogenezei și a testelor de glucoză.

Hepatocitele primare au fost trecute la mediu bazic (DMEM cu 0,2% BSA și 1 mM glutamină, fără glucoză, fenol roșu sau NaPiruvat) timp de 1 oră pentru a induce glicogenoliza și epuiza glicogenul (44). Mediile de bază conținând 10 mM lactat și 1 nM glucagon (pentru a promova gluconeogeneza) și 100 nM insulină (pentru a testa răspunsul la insulină) au fost schimbate și recoltate la fiecare oră timp de 3 ore. Glucoza eliberată a fost măsurată prin reacție enzimatică (testul hexokinazei # GAHK20 Sigma-Millipore) și normalizată la conținutul de proteine ​​per godeu.

Imunoblotarea.

Proteinele au fost izolate în tampon de test radioimunoprecipitare care conține inhibitori de protează și fosfatază (Roche). Probele au fost rezolvate prin SDS/PAGE, șterse și testate cu anticorpi enumerați în apendicele SI, metode suplimentare.

Expresia genelor.

ARN total izolat cu TRIzol tratat cu DNază I a fost transcris invers, iar ADNc a fost cuantificat prin qPCR în timp real (Vii7) utilizând SYBR Green. Datele au fost normalizate folosind metoda metodei Ct pentru moxiproxantină - guanină fosforibosiltransferază (Hprt) și exprimate în raport cu martorul. Secvențele de grund sunt prezentate în anexa SI, tabelul S1.

Analize statistice.

Analizele statistice au fost efectuate folosind GraphPad Prism. ANOVA unidirecțional (univariat) sau bidirecțional (bivariant) a fost urmată de testarea post hoc (Sidak) corectată pentru comparații multiple.

Mulțumiri

Vectorii au fost furnizați cu amabilitate de Dr. S. Guo (IRS1 și IRS2), L. Alonso (shIRS2), M. Montminy (CREB DN), B. Spiegelman (PGC-1B) și T. Jin (TCF4 DN). Această lucrare a fost susținută de subvenții de la Institutele Canadiene de Cercetare în Sănătate (SVB-145591) și Merck, Sharpe & Dohme Corporation (către J.L.E.). P.L.-D. a fost sprijinit de o bursă absolventă de la Montreal Diabetes Research Center; S.J. de post-docul Jean-Coutu (Institut de Recherches Cliniques de Montreal); și J.L.E. de un Chercheur-boursier (Junior 2) de la Fonds de Recherche de Quebec Santé.

Note de subsol

  • ↵ 1 Cui trebuie să i se adreseze corespondența. E-mail: jennifer.estallircm.qc.ca .