Y C. și Q.M. a contribuit în mod egal la acest studiu.

leucină

Abstract

OBIECTIV Țesutul adipos alb (WAT) și țesutul adipos maro (BAT) joacă roluri distincte în adaptarea la schimbările în disponibilitatea nutrienților, WAT servind ca depozit de energie și termogeneza care reglează BAT. Am arătat anterior că șoarecii menținuți pe o dietă cu deficit de leucină au experimentat în mod neașteptat o reducere dramatică a masei grase abdominale. Cu toate acestea, mecanismele celulare responsabile de această pierdere nu sunt clare. Scopul studiului actual este de a investiga posibile mecanisme.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII Șoarecii masculi C57BL/6J au fost hrăniți fie cu dietă martor, cu deficit de leucină, fie cu hrană pereche timp de 7 zile. Modificările parametrilor metabolici și ale expresiei genelor și proteinelor legate de metabolismul lipidic au fost analizate în WAT și BAT.

REZULTATE Am constatat că lipsa de leucină timp de 7 zile crește consumul de oxigen, sugerând o creștere a cheltuielilor de energie. De asemenea, am observat creșteri ale lipolizei și exprimării genelor de β-oxidare și scăderi ale expresiei genelor lipogene și ale activității acidului gras sintază în WAT, în concordanță cu utilizarea crescută și, respectiv, cu sinteza scăzută a acizilor grași. Mai mult, am observat că privarea de leucină crește expresia proteinei de decuplare (UCP) -1 în BAT, sugerând termogeneza crescută.

CONCLUZII Arătăm pentru prima dată că eliminarea leucinei dietetice produce modificări metabolice semnificative în WAT și BAT. Efectul privării de leucină asupra expresiei UCP1 este o observație nouă și neașteptată și sugerează că creșterea observată a cheltuielilor de energie poate reflecta o creștere a termogenezei în BAT. Va fi necesară o investigație suplimentară pentru a determina contribuția relativă a reglării în sus a UCP1 și a termogenezei în BAT la pierderea de grăsime stimulată de lipsa de leucină.

Obezitatea se dezvoltă dintr-un dezechilibru între aportul de calorii și consumul de energie (1). Excesul de calorii este stocat în țesutul adipos alb (WAT) sub formă de trigliceride (TG), care sunt mobilizate ca răspuns la cererea crescută de energie (2). Au fost propuse diferite strategii pentru tratarea obezității prin promovarea mobilizării grăsimilor și/sau creșterea cheltuielilor de energie (3-5).

Recent, a existat un interes tot mai mare în controlul greutății corporale prin manipularea macronutrienților (6-8). Studii recente au arătat că manipularea dietetică a aminoacizilor esențiali, inclusiv leucina, arginina și glutamina, au efecte semnificative asupra metabolismului lipidelor și a utilizării glucozei (9-14). Majoritatea acestor studii s-au concentrat însă asupra efectelor nivelurilor crescute de aminoacizi esențiali din dietă (4.14-18). De exemplu, Zhang și colab. (15) a demonstrat recent că dublarea aportului de leucină din dietă scade greutatea corporală și îmbunătățește metabolismul glucozei la șoarecii menținuți pe o dietă bogată în grăsimi. Efectul creșterii leucinei dietetice este totuși controversat. Studii suplimentare au arătat că suplimentarea dietetică a leucinei nu are niciun efect asupra metabolismului lipidic (16).

În schimb, cercetările noastre s-au concentrat asupra efectului eliminării leucinei din dietă asupra metabolismului lipidelor. După cum am raportat recent, șoarecii menținuți pe o dietă cu deficit de leucină timp de 7 zile au experimentat o reducere dramatică a masei grase abdominale (9). Cu toate acestea, mecanismele celulare responsabile de această pierdere nu sunt clare. Scopul cercetărilor noastre actuale este de a elucida mecanismele moleculare și celulare care stau la baza pierderii rapide de grăsime abdominală induse de lipsa de leucină.

În studiul nostru actual, am observat creșteri ale lipolizei și exprimării genelor de β-oxidare și scăderi ale expresiei genelor lipogene și ale activității acidului gras sintază (FAS) în WAT, în concordanță cu utilizarea crescută și, respectiv, cu sinteza scăzută a acizilor grași. În plus, am observat pentru prima dată că privarea de leucină crește expresia proteinei de decuplare (UCP) -1 în țesutul adipos maro (BAT), sugerând termogeneza crescută. Ipotezăm că aceste modificări ale WAT și BAT reprezintă pierderea semnificativă a masei adipoase abdominale sub lipsa de leucină.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Animale și diete.

Calorimetre indirecte.

După 6 zile de hrănire cu diete de control, cu deficit de leucină sau cu hrană pereche, șoarecii au fost menținuți într-un sistem cuprinzător de monitorizare a animalelor de laborator (Columbus Instruments, Columbus, OH) timp de 24 de ore, conform instrucțiunilor producătorului. Volumul consumului de O2 și producția de CO2 au fost înregistrate continuu pe o perioadă de 24 de ore.

Măsurarea temperaturii rectale.

Temperaturile rectale ale șoarecilor au fost măsurate folosind o sondă rectală atașată la un termometru digital (Physitemp, Clifton, NJ).

Măsurarea consumului de oxigen.

Adipocitele maronii au fost izolate și consumul de oxigen a fost măsurat folosind un electrod de oxigen de tip Clark (Hansatech Instruments, Norfolk, Marea Britanie), așa cum s-a descris anterior (19), cu modificări minore. Fiecare probă a fost analizată prin incubarea a 1 × 106 celule într-o cameră cu agitare magnetică la 37 ° C. După ce s-a înregistrat respirația bazală, s-a adăugat 5 mmol/l oleat pentru a determina consumul maxim de oxigen.

Măsurătorile serice.

Serul a fost obținut prin centrifugarea sângelui coagulat și apoi congelat rapid în azot lichid și depozitat la -20 ° C. Acizii grași fără ser și glicerolul au fost determinați enzimatic folosind un reactiv NEFA C (Wako) și respectiv un kit de testare a glicerinei (SinoPCR, China). Norepinefrina serică, hormonul tiroidian 3,5,3'-triiodotironină (T3), epinefrina și nivelurile de glucocorticoizi au fost determinate folosind kituri de testare imunosorbente legate de enzime (Research & Diagnostics Systems, Minneapolis, MN). Toate aceste teste au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului.

Analiza volumului celular și a conținutului de ADN în WAT.

WAT a fost fixat în paraformaldehidă 4% peste noapte și colorat cu hematoxilină și eozină. Volumele de celule WAT au fost analizate așa cum s-a descris anterior (20). Conținutul de ADN din probele WAT a fost cuantificat așa cum sa raportat anterior (21).

Analiza Western blot.

Lizatele cu celule întregi din țesuturile înghețate au fost izolate folosind tampon de liza cu test de radioimunoprecipitare (RIPA) (150 mmol/l Tris-HCI, 50 mmol/l NaCI, 1% NP-40, 0,1% Tween-20). Inhibitorii de protează și fosfatază au fost adăugați la toate tampoanele înainte de experimente. Western blot a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (9). Concentrațiile de proteine ​​au fost testate folosind un kit BCA (Pierce). Anticorpi primari [anticorp anti-FAS] [BD Scientific], anti-PPARα, anti-p-HSL, anti-HSL, anti-p-PKA anticorpi substrat [Semnalizare celulară], anticorp anti-actin [Sigma] și anti- SREBP1c și anticorpii anti-UCP1 [Santa Cruz Biotechnology]) au fost incubați peste noapte la 4 ° C, iar proteinele specifice au fost vizualizate de ECL Plus (Amersham Biosciences). Intensitățile benzilor au fost măsurate utilizând Cantitatea Unu (Laboratoarele Bio-Rad) și normalizate la actină.

Testul activității enzimei FAS.

Activitatea FAS a fost determinată așa cum este descris de Kim și colab. cu modificări minore (22). Rata de oxidare a NADPH a fost măsurată la 340 nm înainte și după adăugarea substratului malonil-CoA. Concentrația enzimei a fost ajustată pentru a asigura o viteză de reacție liniară. Concentrația de proteine ​​în omogenizat a fost determinată de setul BCA (Pierce).

Izolarea ARN și RT-PCR cantitativ relativ.

ARN-ul total a fost preparat din țesuturi înghețate cu reactiv TRIZOL (Invitrogen). O microgramă de ARN a fost transcrisă invers cu un primer aleatoriu (Invitrogen) și M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Amplificarea cantitativă prin PCR a fost efectuată utilizând reactivul SYBR Green I Master Mix de către un sistem ABI 7500 (Applied Biosystem). Produsele PCR au fost supuse unei analize a curbei de topire. Numerele de ciclu atât ale GAPDH (ca control intern), cât și ale ADNc-urilor de interes la un prag specific în intervalul de amplificare exponențială au fost utilizate pentru a calcula nivelurile de expresie relativă ale genelor de interes. Secvențele de grunduri utilizate în acest studiu sunt disponibile la cerere.

Test de eliberare a glicerolului.

WAT a fost îndepărtat și incubat în tampon Krebs-Ringer HEPES conținând 1 mg/ml colagenază (Sigma) și 2% albumină serică bovină așa cum s-a descris anterior (23). Adipocitele proaspăt izolate au fost incubate în tampon Krebs-Ringer HEPES conținând adenozin deaminază (Sigma) în absența sau prezența izoproterenolului (1 μmol/l), urmată de testarea glicerinei cu setul de testare a glicerolului (SinoPCR, China).

analize statistice.

Greutatea corporală și masa grasă scad la șoarecii lipsiți de leucină. Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă martor, cu deficit de leucină sau cu hrană pereche timp de 7 zile. Greutatea corporală și aportul de alimente au fost monitorizate zilnic. Datele sunt media ± SE a cel puțin două experimente independente cu șoareci din fiecare dietă pentru fiecare experiment (dieta de control, n = 6; (-) dietă de leu, n = 6; dietă hrănită în perechi, n = 6). Semnificația statistică a fost determinată de ANOVA unidirecțional, urmată de testul Student-Newman-Keuls, pentru efectul fie (-) leu, fie al dietei hrănite în pereche versus dieta control (* P co 2/V o 2) a fost scăzut în leucină- șoareci lipsiți atât în ​​fazele întunecate, cât și în fazele luminoase. În schimb, șoarecii hrăniți în perechi au prezentat RER mai mic doar în timpul fazei luminoase (Fig. 2B). Temperaturile rectale măsurate la 15:00 după-amiaza (starea metabolică bazală) au fost semnificativ mai mari la șoarecii lipsiți de leucină, dar au fost mai mici la șoarecii hrăniți în perechi, comparativ cu șoarecii menținuți pe o dietă de control (Fig. 2C). Cu toate acestea, nu am văzut diferențe semnificative în temperaturile rectale în alte momente examinate (dimineața sau seara, datele nu sunt prezentate). De asemenea, nu am văzut o activitate fizică crescută la șoarecii lipsiți de leucină, măsurată într-o cușcă metabolică (Fig. 2D).

Privarea de leucină crește cheltuielile cu energia. Cheltuielile de energie au fost măsurate prin calorimetrie indirectă la șoareci hrăniți cu o dietă martor, cu deficit de leucină sau hrănită în perechi timp de 7 zile. A: consum de oxigen 24 de ore. B: RER. Un RER de 0,70 indică faptul că grăsimea este sursa predominantă de combustibil; un RER de 0,85 sugerează un amestec de grăsimi și carbohidrați, iar o valoare ≥1,00 indică faptul că carbohidrații sunt sursa predominantă de combustibil. C: temperatura rectală. D: Activitate fizică. Datele sunt media ± SE a cel puțin două experimente independente cu șoareci din fiecare dietă pentru fiecare experiment (dieta de control, n = 6; (-) dietă leu, n = 6; dietă hrănită în perechi, n = 6) peste 24-48 h după 6-h aclimatizare în camera metabolică. Semnificația statistică a fost determinată de ANOVA unidirecțional, urmată de testul Student-Newman-Keuls pentru efectul fie (-) leu, fie al dietei hrănite în perechi versus dieta de control (* P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Măsurătorile serice la șoareci menținute pe diferite diete

Privarea de leucină reduce volumul celulelor WAT.

Pierderea de grăsime abdominală indusă de lipsa de leucină poate rezulta din scăderea volumului și/sau numărului adipocitelor. Analiza histologică a WAT ​​a arătat că privarea de leucină a dus la o reducere de 42% a volumului de adipocite în comparație cu șoarecii hrăniți cu o dietă de control (Fig. 3A și B). Prin contrast, volumul adipocitelor a fost doar ușor redus la șoarecii hrăniți în perechi (Fig. 3A și B). Cu toate acestea, numărul de celule a fost același la șoarecii menținuți pe fiecare dintre cele trei diete, după cum a demonstrat conținutul de ADN (Fig. 3C). În concordanță cu aceste constatări, nu s-a detectat apoptoză prin colorarea dUTP mediată prin Tdt prin marcarea nick-up (TUNEL) la șoareci menținuți pe o dietă cu deficit de leucină (datele nu sunt prezentate).