Abstract

Preocupările de siguranță cu privire la di- (2-etilhexil) ftalatul (DEHP), un plastifiant și un perturbator endocrin probabil, au atras atenția publicului considerabil, dar există puține studii privind expunerea pe termen lung la DEHP. Se crede că toxicitatea DEHP implică receptorul α activat de proliferatorul peroxizomului (PPARα), dar această afirmație rămâne controversată. Pentru investigarea toxicității pe termen lung a DEHP și determinarea dacă PPARα mediază toxicitatea, șoarecii de tip sălbatic și PPARα-nul au fost hrăniți cu o dietă care conținea 0,05 sau 0,01% DEHP timp de 22 de luni. Șoarecii PPARα-nuli care au fost expuși la DEHP au prezentat glomerulonefrita proeminentă a sistemului imunitar, cel mai probabil legată de stresul oxidativ glomerular crescut. NADPH oxidază crescută, enzime antioxidante scăzute și absența efectelor antiinflamatoare dependente de PPARα care antagonizează în mod normal calea de semnalizare NFκB însoțită de glomerulonefrită la șoarecii PPARα-nul. Rezultatele raportate aici indică faptul că PPARα protejează împotriva efectelor nefrotoxice ale expunerii pe termen lung la DEHP.

proliferator

Di- (2-etilhexil) ftalatul (DEHP), un perturbator endocrin probabil, este utilizat pe scară largă ca plastifiant pentru producerea multor tipuri de produse de consum ale clorurii de polivinil (PVC). DEHP oferă articole din PVC cu proprietățile mecanice dorite, inclusiv flexibilitate și rezistență. Prezența DEHP în mediu a fost confirmată, la fel ca și expunerea umană la DEHP legată de produs; evaluările recente de siguranță ale DEHP au atras astfel un interes public larg (1). DEHP intră continuu în corpul uman prin alimente, apă și atmosferă. Mai mult decât atât, expunerea substanțială a omului la DEHP are loc prin intermediul dispozitivelor medicale care conțin PVC, care sunt utilizate în terapia intravenoasă, în susținerea nutriției enterale și parenterale, în transfuzia de sânge, în hemodializă, în bypassul cardiopulmonar și în oxigenarea membranelor extracorporale (2). Expunerea medicală maximă a fost estimată a fi aproape de nivelul SUA fără efecte adverse observate (3,7 până la 14 mg/kg corp în greutate pe zi). Multe studii anterioare experimentale pe animale nu au dat dovezi evidente ale toxicității DEHP la aceste niveluri scăzute de expunere, dar perioadele de expunere din studii au fost în general scurte. Expunerea pe termen lung la DEHP este importantă pentru evaluarea siguranței toxicității din lumea reală.

Studiul nostru a fost conceput pentru a îndeplini două obiective: Determinarea dacă expunerea dietetică la DEHP (0,01 sau 0,05%) timp de 22 de luni induce toxicitate și stabilirea relației dintre PPARα și toxicitatea indusă de DEHP prin compararea efectelor obținute între tipul sălbatic și Șoareci PPARα-nul. Expunerea pe termen lung a dietei la glomerulonefrita indusă de DEHP la șoareci PPARα-nul.

Materiale și metode

Animale și tratament DEHP

Analize histopatologice

Analize imunoblot

Pentru analize imunoblot, glomerulii au fost izolați din toți rinichii din fiecare grup de șoareci, folosind o metodă de cernere descrisă anterior (17). Extractele glomerulare au fost supuse la 9 până la 15% SDS-PAGE și apoi transferate în membranele de nitroceluloză. Aceste membrane au fost incubate cu anticorp primar, urmate de incubare cu fosfatază alcalină - anticorp secundar conjugat. Anticorpii policlonali primari pentru catalază au fost preparați folosind catalază purificată (18). Anticorpii primari împotriva actinei α-musculare netede (α-SMA) și 4-HNE au fost achiziționați de la DakoCytomation (Glostrup, Danemarca) și, respectiv, Alexis Corp Alți anticorpi primari, împotriva antigenului nuclear celular proliferant, TGFβ1, Nox4, p47phox, Cu, Zn-superoxid dismutază (SOD), Mn-SOD și glutation peroxidază, au fost obținuți de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Analize ale ARNm

Analizele ARNm au fost efectuate folosind un PCR în timp real. O microgramă de ARN total a fost extrasă din glomerulii izolați ai fiecărei grupe și transcrisă invers utilizând primeri oligo (dT) și transcriptază inversă Superscript (Invitrogen, Carlsbad, CA). ADNc au fost cuantificate cu un sistem de detectare a secvenței ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA), folosind primerii specifici și colorantul de legare ADN dublu catenar SYBR Green (dsDNA) I. Primerii specifici au fost proiectați după cum urmează: 5'-CCTCAGGGTACCACTACGGAGT -3 'și 5'-GCCGAATAGTTCGCCGAA-3' pentru PPARα (acces GenBank nr. NM_011144); 5'-TTCCACTATGGAGTTCATGCTTGT-3 'și 5'-TCCGGCAGTTAAGATCACACCTA-3' pentru PPARγ (NM_011146); 5'-CACCTGCAAGACCATCGACAT-3 'și 5'-TGGCGAGCCTTAGTTTGGA-3' pentru TGFβ1 (NM_011577); 5'-GCCCCGCACAGCCATGTTTCAG-3 'și 5'-CATGGAGTCCAGGCCGCTGTCGTG-3' pentru IκBα (U36277); 5'-TGACCCCCAAGGCTCAAATATG-3 'și 5'-ACCCAGGTCCTCGCTTATGAT-3' pentru ciclooxigenază2 (NM_011198); 5′-TCCGGACTTTCGATCTTCCA-3 ′ și 5′-GAGCTTCAGAGGCAGGAAACA-3 ′ pentru molecula de adeziune intercelulară 1 (M31585), 5′-CAGCCGATGGGTTGTACCTT-3 ′ și 5′-GTGGGTGAGGAGCACGTAG; 5'-CGTCCTGACAATGCAGACCTT-3 'și 5'-CCCCATGAAACGCATGAACT-3' pentru receptorul TNF 1 (TNR1) (M60468). Gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază a fost utilizată ca control intern pentru amplificarea PCR.

Măsurarea concentrației serice de mono (2-etilhexil) ftalat

Concentrația serică de mono (2-etilhexil) ftalat (MEHP) a fost măsurată așa cum s-a descris anterior (19). Pe scurt, MEHP a fost extras din probe de ser cu acetat de etil. N-metil-N- (terț-butil-dimetilsilil) trifluoroacetamidă (GL Sciences, Tokyo, Japonia) a fost adăugată la extractele MEHP și lăsată la temperatura camerei timp de 60 min. Derivatul de terț-butil-dimetilsilil MEHP a fost analizat prin cromatografie gazoasă cu detecție selectivă a masei (6890 N, 5973 N; Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Probele serice de pacienți cu hemodializă (HD) și voluntari sănătoși au fost colectate în iulie 2006 cu consimțământul informat în scris. Acest studiu a fost realizat în conformitate cu Declarația de la Helsinki. Consimțământul informat semnat pentru a participa la studiu a fost obținut de la toți pacienții, iar protocoalele studiului au fost aprobate de Comitetul de Etică Medicală al Școlii de Medicină a Universității Shinshu.

Măsurători ale anticorpului anti-dsDNA și 50% activitate complementară hemolitică

Titrul anticorpului anti-ADNs seric a fost determinat de ELISA așa cum s-a arătat anterior (20). Activitatea complementară hemolitică standard de 50% (CH50) a fost măsurată așa cum s-a descris anterior (21).