Afiliere Pennington Biomedical Research Center/LSU System, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

mutantă

Afiliere Pennington Biomedical Research Center/LSU System, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center/LSU System, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center/LSU System, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center/LSU System, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center/LSU System, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

  • Linnea R. Freeman,
  • Le Zhang,
  • Kalavathi Dasuri,
  • Sun-Ok Fernandez-Kim,
  • Annadora J. Bruce-Keller,
  • Jeffrey N. Keller

Cifre

Abstract

Mutațiile proteinei precursoare amiloide (APP) au fost studiate cel mai intens în țesutul cerebral pentru legătura lor cu patologia bolii Alzheimer (AD). Cu toate acestea, APP este foarte exprimat într-o varietate de țesuturi, inclusiv țesut adipos, unde APP este, de asemenea, cunoscut pentru a prezenta o expresie crescută ca răspuns la obezitate. În studiul nostru actual, am analizat efectele expresiei APP mutante (E693Q, D694N, K670N/M671L) asupra mai multor aspecte ale homeostaziei țesutului adipos. Aceste date relevă hipoleptinemie semnificativă, scăderea adipozității și dimensiunea redusă a adipocitelor ca răspuns la APP mutant, iar acest lucru a fost complet inversat după administrarea unei diete bogate în grăsimi. În plus, sa observat că APP mutant exacerbează în mod semnificativ rezistența la insulină, creșterea trigliceridelor și infiltrarea macrofagelor în țesutul adipos ca răspuns la o dietă bogată în grăsimi. Luate împreună, aceste date au implicații semnificative pentru legarea expresiei mutante a APP cu disfuncția țesutului adipos și schimbările globale ale funcției endocrine și metabolice atât în ​​condiții obezogene, cât și în condiții non-obezogene.

Citare: Freeman LR, Zhang L, Dasuri K, Fernandez-Kim S-O, Bruce-Keller AJ, Keller JN (2012) Proteina precursor amiloid mutant modifică diferențial biologia adipoasă în condiții obezogene și non-obezogene. PLoS ONE 7 (8): e43193. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043193

Editor: Hemachandra Reddy, Oregon Health & Science University, Statele Unite ale Americii

Primit: 4 iunie 2012; Admis: 20 iulie 2012; Publicat: 17 august 2012

Finanțarea: Această lucrare a utilizat facilitățile nucleului de biologie celulară și bioimaginare, care sunt susținute în parte de COBRE (National Institutes of Health [NIH] 2P20-RR021945) și NORC (NIH 2P30-DK072476) subvenții ale centrului de la NIH, Pennington Animal Metabolism și Core de comportament și fonduri de la Banca Națională Hibernia/catedra Edward G Schleider (JNK). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Proteina precursoare amiloidă (APP) este exprimată într-o varietate de țesuturi, inclusiv creier, mușchi scheletic, țesut adipos și testicule [1] - [5]. Majoritatea studiilor pentru APP s-au concentrat pe legătura sa cu patogeneza bolii Alzheimer (AD), produsele de decolteare din APP fiind cunoscute ca fiind o componentă semnificativă a plăcilor amiloide observate atât în ​​creșterea cât și în creierul AD [6] - [8]. În mod similar, APP este implicat în generarea incluziunilor proteice observate în țesutul muscular ca urmare a incluziunii miozitei corpului [9], [10]. Rolul biologic al APP în țesutul adipos nu a fost încă bine stabilit, deși APP este cunoscut a fi crescut în celulele adipoase ca răspuns la obezitate la om și șoareci [1], [2], [11]. Contribuțiile specifice ale APP la complicațiile obezității rămân în mare parte nedefinite. Mai mult, impactul mutațiilor APP asociate cu AD și angiopatia amiloidă cerebrală (CAA) [12] - [14] nu au fost bine stabilite în țesutul adipos. Înțelegerea potențialului pentru APP și expresia APP mutantă pentru a modula aspecte specifice ale funcției endocrine și metabolice asociate adipozei poate oferi o perspectivă nouă asupra modului în care expresia APP periferică contribuie la schimbările fiziologice globale și, eventual, la modularea homeostaziei creierului.

S-a crezut cândva că grăsimea era în mare parte un țesut inert, țesutul adipos fiind legat doar periferic de metabolism. Știm acum că țesutul adipos este esențial pentru reglarea homeostaziei energetice în condiții fiziologice (echilibrarea homeostaziei energetice ca răspuns la cheltuielile de energie și la aportul de energie) [11], [15] și contribuie la boli metabolice (rezistență la insulină) ca răspuns la obezitate [16], [17]. În ambele paradigme, țesutul adipos își mediază efectele asupra organismului prin secreția de adipokine [11], [18], [19] și prin sechestrarea și eliberarea de substraturi energetice, inclusiv acizi grași și glucoză [11], [20]. ].

În studiul actual, am analizat mai multe aspecte ale biologiei adipoase, semnalizării adipokinei și rezistenței la insulină folosind un model de șoarece stabilit de CAA [21] - [23]. Acest model de mouse folosește promotorul Thy-1 pentru a conduce expresia APP mutantă (E693Q, D694N, K670N/M671L) care este exprimată abundent în creier și țesut adipos [21], [24], [25]. În condiții dietetice non-obezogene, expresia APP mutant în țesutul adipos a dus la hipoleptinemie severă, scăderea semnificativă a dimensiunii adipocitelor și o scădere globală a cantității de țesut adipos. În mod interesant, în condiții obezogene a existat o inversare completă a fiecăruia dintre aceste efecte asociate cu APP mutante și o exacerbare concomitentă a rezistenței la insulină indusă de obezitate, creșterea trigliceridelor și infiltrarea macrofagelor. Acest studiu identifică efectele noi ale expresiei APP mutante asupra țesutului adipos în condiții obezogene și non-obezogene și oferă un nou model prin care expresia periferică a APP mutante ar putea contribui la patogeneza creierului și la complicațiile obezității.

Materiale și metode

Animale și tratamente dietetice

Șoarecii C-HF au fost semnificativ mai grei decât toate celelalte grupuri (p Figura 2. Histologia depozitelor de grăsime.

Șoarecii CAA-CD au dezvăluit adipocite semnificativ mai mici comparativ cu toate celelalte grupuri atât pentru depozitele de grăsime subcutanată (Figura 2A), cât și pentru cea viscerală (Figura 2B). Șoarecii CAA-HF au crescut dimensiunea adipocitelor comparativ cu omologii lor hrăniți cu control, care au fost mai comparabili cu șoarecii de control, dar au relevat unele semne de inflamație și fibroză, în special în grăsimea viscerală.

Histologie

Probele de grăsime viscerală și subcutanată au fost păstrate în formalină timp de 10-12 zile și apoi prelucrate pentru încorporarea parafinei. Probele au fost secționate la 5 pm și apoi colorate cu hemotoxilină și eozină. Diapozitivele au fost scanate folosind un sistem digital de scanare a diapozitivelor Hamamatsu NanoZoomer (Hamamatsu City, Japonia) la o mărire de 20X.

Nivelurile de ARNm PPAR γ și C/EBPα au fost semnificativ mai mari în grăsimea subcutanată C-CD comparativ cu toate celelalte grupuri (p Figura 4. Analiza preadipocitelor 3T3-L1 care exprimă APP mutant.

Nu s-au determinat diferențe semnificative în adipokine, factori de diferențiere sau lipaze (Figura 4A - F) între preadipocite care exprimă APP mutant și vectorul gol. Cu toate acestea, leptina redusă a fost observată pentru adipocite care exprimă APP mutant (Figura 4A).

Analiza serului

Sângele colectat la eutanasiere prin puncție cardiacă a fost lăsat să se coaguleze peste noapte și apoi centrifugat. Serul a fost izolat și analizat folosind ELISA pentru: Leptină (R&D Systems, Minneapolis, MN), Resistin (R&D Systems, Minneapolis, MN) și Adiponectin (R&D Systems, Minneapolis, MN). Pe scurt, anticorpul de captură a fost incubat pe microplaca cu 96 de godeuri peste noapte, probele de ser și standardele au fost încărcate în duplicat a doua zi, anticorpul de detectare a fost aplicat și incubat timp de 2 ore și apoi Streptavidin-peroxidază de hrean (HRP) și Tetrametil Benzidină (TMB; Cromogenul Life Technologies, Grand Island, NY) a fost utilizat pentru a cataliza reacția de schimbare a culorii. Plăcile au fost citite la 450 nm cu corecția lungimii de undă setată la 570 nm. Serul a fost, de asemenea, analizat folosind un kit colorimetric cantitativ pentru măsurarea trigliceridelor (Wako, Osaka, Japonia).

Ambele depozite de grăsimi au relevat o creștere a leptinei la șoarecii hrăniți cu dieta HF (Figura 6A și B). O creștere semnificativă a leptinei a fost determinată pentru șoarecii CAA-HF comparativ cu C-CD și CAA-CD în grăsimea viscerală. Șoarecii CAA-CD au avut o expresie mai mică a leptinei în ambele tampoane de grăsime comparativ cu toate celelalte grupuri. Șoarecii C-HF au avut o expresie de rezistență semnificativ mai mică în grăsimea viscerală comparativ cu CAA-CD (p = 0,039; Figura 6D), șoarecii CAA-CD au avut o expresie a adiponectinei semnificativ mai mică comparativ cu șoarecii C-CD și C-HF în grăsimea subcutanată (p = 0,005 și, respectiv, p = 0,014; Figura 6E) și șoarecii C-HF au avut expresie de adiponectină semnificativ mai mică în grăsimea viscerală comparativ cu C-CD (p = 0,020; Figura 6F).

Cultură de celule

Preadipocitele 3T3-L1 murine au fost cultivate în mediul de creștere al preadipocitelor 3T3-L1. Mediul a fost schimbat la fiecare 48 de ore. Pentru a obține adipocite complet diferențiate, preadipocitele 3T3-L1 au fost crescute la 2 zile după confluență și induse să se diferențieze prin schimbarea mediului în mediu DMEM cu conținut ridicat de glucoză conținând 10% FBS și 0,5 mM IBMX, 1 µM dexametazonă, 1,7 µM insulină (MDI ) și antibiotice (100 unități/ml penicilină G și 100 μg/ml streptomicină). După 48 de ore, acest mediu a fost înlocuit cu mediu DMEM cu conținut ridicat de glucoză suplimentat cu 10% FBS, penicilină/strepomicină și 0,425 uM insulină. Mediile au fost înlocuite la fiecare 2 zile după aceea, utilizând glicemie ridicată DMEM, mediu FBS 10% și antibiotice. Celulele au fost complet diferențiate cu 6 zile; au fost colectate la 7-10 zile după tratamentul MDI pentru o analiză ulterioară.

Șoarecii hrăniți cu CAA-HF au avut niveluri semnificativ mai mari de trigliceride în comparație cu șoarecii C-CD (p = 0,011, Figura 7A). O reducere semnificativă a mARN-ului HSL s-a găsit în grăsimea subcutanată pentru CAA-CD și CAA-HF comparativ cu C-CD (CAA-CD în C-CD: p = 0,033, CAA-HF în C-CD: p = 0,002 Figura 7B). Pe de altă parte, șoarecii CAA-CD au prezentat HSL crescut în grăsimea viscerală comparativ cu șoarecii C-HF și CAA-HF (p = 0,023 și, respectiv, p = 0,026). Șoarecii CAA-CD au avut expresie ARNm LPL semnificativ mai mică în grăsimea subcutanată comparativ cu toate celelalte grupuri, dar nu s-au găsit diferențe semnificative pentru LPL în grăsimea viscerală.

RT-PCR

Șoarecii hrăniți cu CAA-HF au prezentat o creștere semnificativă a nivelurilor de glucoză pe parcursul testului, comparativ cu toate celelalte grupuri (p Figura 9. Infiltrarea macrofagelor în depozitele de grăsime.

În grăsimea subcutanată, C-HF și CAA-HF au dezvăluit cele mai „structuri asemănătoare coroanei”. Acestea au fost rareori găsite în probele de grăsime subcutanată C-CD sau CAA-CD (Figura 9A). Depozitele de grăsime viscerală au dezvăluit un număr mai mare de macrofage și structuri asemănătoare coroanei (Figura 9B). Au fost găsite în CAA-CD, C-HF și CAA-HF și rareori au fost găsite în probele C-CD. Asteriscurile marchează celulele cu structuri asemănătoare coroanei.

Analize statistice

Efectele APP mutante asupra țesutului adipos includ: hipoleptinemie severă, scăderea adipozității și dimensiunea redusă a adipocitelor. Aceste efecte au fost inversate în condiții obezogene, dar această inversare a fost însoțită de creșteri asociate cu APP mutante ale rezistenței la insulină, creșterea trigliceridelor circulante și creșterea infiltrării macrofagelor în țesutul adipos visceral.

Rezultate

Greutăți corporale și compoziție corporală