Geng-Ruei Chang

1 Departamentul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Chung Hsing, Taichung, Taiwan

2 Divizia de control al reziduurilor, Institutul de cercetare a substanțelor chimice agricole și a substanțelor toxice, Consiliul Agriculturii, Taichung, Taiwan

Yi-Shin Chiu

1 Departamentul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Chung Hsing, Taichung, Taiwan

Ying-Ying Wu

1 Departamentul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Chung Hsing, Taichung, Taiwan

Yu-Chi Lin

1 Departamentul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Chung Hsing, Taichung, Taiwan

Po-Hsun Hou

1 Departamentul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Chung Hsing, Taichung, Taiwan

3 Departamentul de Psihiatrie, Spitalul General al Veteranilor din Taichung, Taichung, Taiwan

Frank Chiahung Mao

1 Departamentul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Chung Hsing, Taichung, Taiwan

Date asociate

Tabelul S1 Compoziția dietelor experimentale.

Tabelul S2 Efectele rapamicinei asupra greutății corporale, efectele metabolice, nivelurile serice de leptină, greutatea organelor și scorurile ficatului gras ale șoarecilor slabi tratați timp de 35 de zile cu vehicul sau rapamicină.

Abstract

Context și scop

Rapamicina, care este utilizată clinic pentru tratarea respingerii grefelor, a fost, de asemenea, propusă pentru a avea un efect asupra sindromului metabolic; cu toate acestea, sunt disponibile foarte puține informații despre efectele sale la animale slabe/oameni. Scopul acestui studiu a fost de a caracteriza în continuare efectele utilizării continue a rapamicinei asupra homeostaziei glucozei la șoarecii slabi C57BL6/J.

Abordare experimentală

Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă bogată în proteine ​​(HPD) timp de 12 săptămâni pentru a dezvolta un model slab și apoi au fost tratați zilnic cu rapamicină timp de 5 săptămâni în timp ce au rămas pe un HPD. Parametrii metabolici, profilurile endocrine, testele de toleranță la glucoză, indicele de sensibilitate la insulină, expresia transportorului de glucoză GLUT4 și distribuția cromului au fost măsurate in vivo.

Rezultate cheie

Creșterea mai mică în greutate corporală, precum și un aport caloric redus, tampoane de grăsime, scoruri hepatice grase, mărimea adipocitelor și valori ale testului de toleranță la glucoză au fost observate la șoarecii hrăniți cu HPD comparativ cu șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi sau standard. În ciuda acestor efecte benefice, șoarecii slabi tratați cu rapamicină au prezentat o intoleranță mai mare la glucoză, o sensibilitate redusă la insulină, o expresie GLUT4 musculară mai mică și modificări ale nivelurilor de crom în țesuturi chiar și cu niveluri ridicate de insulină.

Concluzie și implicații

Descoperirile noastre demonstrează că administrarea continuă de rapamicină poate duce la dezvoltarea sindromului diabetului zaharat, deoarece s-a constatat că induce hiperglicemie și intoleranță la glucoză într-un model animal slab.

Tabelele de legături

OBIECTIVE
Transportatori A Enzime b
GLUT4Act (PKB)
mTOR
S6K1

Aceste tabele listează țintele și liganzii proteine ​​cheie din acest articol, care sunt hyperlinkați la intrările corespunzătoare din http://www.guidetopharmacology.org, portalul comun pentru date din Ghidul IUPHAR/BPS pentru PHARMACOLOGY (Pawson și colab., 2014) și sunt arhivate permanent în Ghidul concis pentru FARMACOLOGIE 2013/14 (a, b Alexander și colab., 2013a, b).

Introducere

Diabetul de tip 2 este o tulburare recunoscută de supraîncărcare a nutrienților care apare la subiecții obezi atunci când eliberarea de insulină de către celulele beta pancreatice care nu funcționează nu reușește să controleze nivelul glicemiei ca răspuns la rezistența la insulină (Kahn și colab., 2006). Restricția energetică, în special cu mai mult de 50% din energie ca proteină, este un tratament alternativ obișnuit și de succes pentru obezitate, care este de obicei eficient în obținerea pierderii în greutate corporală și prevenirea apariției ulterioare a diabetului (St Jeor și colab., 2001). Mai mult, persoanele cu diabet de tip 2 hrănite cu o dietă bogată în proteine ​​(HPD) au scăzut nivelul glicemiei postprandiale și au îmbunătățit controlul global al glucozei (Gannon și colab., 2003). Cu toate acestea, suplimentarea bogată în proteine ​​a fost corelată cu promovarea vindecării rănilor, protecția împotriva șocului, malnutriției, controlului anemiei, dezvoltarea edemului și îmbunătățirea apărării imune după intervenția chirurgicală și leziunile arse (Spence și colab., 1946).

Metode

Tratamentul animalelor și medicamentelor

Șoarecii masculi C57BL/6J la vârsta de 5 săptămâni, obținuți din Resursele de Cercetare în Educație, Centrul Național pentru Animale de Laborator, Taiwan, au fost utilizați în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, recomandat de guvernul din Taiwan. Protocolul pentru șoareci experimentali a fost, de asemenea, revizuit și aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Universității Naționale Chung Hsing (aprobarea IACUC nr. 98-85). Toate studiile pe animale sunt raportate în conformitate cu liniile directoare ARRIVE pentru raportarea experimentelor care implică animale (Kilkenny și colab., 2010; McGrath și colab., 2010). Un total de 60 de animale au fost utilizate în aceste experimente. Animalele au fost ucise de o supradoză de dioxid de carbon combinat cu anestezic, uretan (1,2 mg kg -1).

Experimentul I

Animalele au fost împărțite în trei grupuri pentru a stabili modelul animal slab: (i) grupul de control: șoarecii au fost hrăniți cu o dietă standard (SD; dieta 5008, 24% dietă îmbogățită în proteine, 49,4% carbohidrați; PMI Nutrition International, Brentwood, MO, STATELE UNITE ALE AMERICII); (ii) grup cu dietă bogată în grăsimi (HFD): șoarecii au fost hrăniți cu HFD (dieta 592Z, 20,4% dietă bogată în proteine ​​și laborator modificat cu 35,5% untură de porc; PMI Nutrition International Inc); (iii) Grup HPD: șoarecii au fost hrăniți cu un grup HPD (dieta 5787, 60,0% dietă îmbogățită în proteine, PMI Nutrition International Inc) (Tabelul de informații de susținere S1). Toate grupurile au fost hrănite ad libitum timp de 12 săptămâni. Șoarecii au fost adăpostiți individual în cuști de rozătoare din plastic standard în încăperi de animale cu temperatură controlată (22 ± 1 ° C), umiditate (55 ± 5%) și un ciclu de lumină - întuneric de 12:12 h. Greutatea corporală a tuturor șoarecilor a fost măsurată timp de 12 săptămâni și apoi analizată.

Experimentul II

Șoarecii masculi C57BL/6J de cinci săptămâni au fost hrăniți cu HPD timp de 12 săptămâni pentru a dezvolta un animal slab cu niveluri normale de glucoză, în urma investigației noastre preliminare descrise în experimentul I. Șoarecii au fost apoi împărțiți în mod aleatoriu în două grupuri la vârsta de 17 săptămâni. Un grup de șoareci a fost injectat cu i.p. rapamicină (2 mg · kg -1 greutate corporală) o dată pe zi timp de 35 de zile (șoareci tratați cu rapamicină alimentați cu HPD; HPDR). Al doilea grup de șoareci, controlul HPD, a primit un volum corespunzător de vehicul (PEG400/8% etanol steril urmat de un volum egal de 10% Tween 80 steril) (Eshleman și colab., 2001; Chang și colab., 2009a). Această doză de rapamicină la șoareci este echivalentă cu o doză de 0,17 mg · kg -1 -1 zi -1 la om atunci când este normalizată la suprafața corpului (Chodera și Feller, 1978; Chang și colab., 2009b) pentru a imita o concentrație terapeutică tipică în studii clinice la om (Saunders și colab., 2001).

Măsurarea greutății corporale, a aportului alimentar/caloric și a concentrației hormonale

Greutatea corporală și aportul alimentar al șoarecilor au fost înregistrate și măsurate săptămânal. Pentru a estima consumul de alimente, aportul de alimente a fost evaluat prin cântărirea alimentelor din fiecare distribuitor de cuști, inclusiv alimentele care au fost vărsate pe podeaua cuștii. În plus, la sfârșitul perioadei de studiu, animalele au fost anesteziate și s-au recoltat diferite țesuturi, precum și ser, pentru analize ulterioare. Concentrațiile serice de leptină și insulină au fost măsurate prin utilizarea kitului de leptină elisa de șoarece și a kitului de insulină elină de șobolan (# 90030 și # INSKR020; Crystal Chem Inc, Downers Grove, IL, SUA).

Analiza histologică și morfometrică a țesuturilor

Am măsurat greutățile inimii, ficatului, splinei, rinichilor, retroperitoneale și epididimale; determinat ca procent din greutatea corporală totală. Infiltrarea grăsimilor în ficat a fost identificată prin colorarea hematoxilinei și a eozinei după cum urmează: fără grăsimi vizibile: scor 0; 50% grăsime: scor 4 (Chang și colab., 2009b).

Au fost obținute numeroase secțiuni din țesut adipos retroperitoneal și epididimal și analizate sistematic în funcție de mărimea și numărul adipocitelor. Colorarea secțiunilor a fost efectuată cu hematoxilină și eozină. Pentru fiecare probă, au fost analizate cel puțin 10 câmpuri (reprezentând ~ 100 adipocite) per lamă (Bluher și colab., 2004). Imaginile au fost achiziționate folosind un microscop digital de înaltă rezoluție (Moticam 2300, Motic Instruments, Canada), iar distribuția mărimii adipocitelor a fost analizată folosind software-ul Motic Images Plus 2.0. Corelarea dimensiunii adipocitelor și distribuția acestuia (%) a fost determinată pentru controlul HFD, controlul HPD și șoarecii tratați cu rapamicină pe un HPD.

Test de toleranță la glucoză

La sfârșitul experimentului I, un i.p. testul de toleranță la glucoză (IPGTT) a fost efectuat la o doză de 1 g · glucoză · kg -1 greutate corporală la animale care au fost postite peste noapte cu acces gratuit la apă. Nivelurile de glucoză din sânge au fost determinate la 0, 30, 60 și 120 de minute după i.p. injectarea de glucoză. Prin experimentul menționat anterior, glucoza din sânge a fost măsurată în sângele prelevat din vena cozii la orele indicate anterior folosind un contor de glucoză One Touch ™ (LifeScan Inc, CA, SUA). Pentru a examina toleranța la glucoză, a fost calculată aria de sub curba de toleranță la glucoză (0-120 min). La fel, în experimentul II, după 28 de zile de tratament cu vehicul sau rapamicină, s-a efectuat un IPGTT și la animalele hrănite cu HPD.

Analiza Western blot

La sfârșitul fiecărui experiment, animalele au fost ucise de o supradoză de anestezic, iar mușchii gastrocnemius au fost îndepărtați rapid, tocate grosier și apoi omogenizați imediat. O Western blot a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Chang și colab., 2009b). Anticorpii utilizați pentru analiza Western blot au fost după cum urmează: anticorpi anti-GLUT4, anti-fosfo-S6K (fosfotreonină 389-specifică), anti-S6K și anti-actină. Semnalele imunoreactive au fost detectate folosind reactivi de chemiluminescență îmbunătățite, iar membranele au fost expuse pe pelicule cu raze X. Cuantificarea expresiei și fosforilării proteinelor a fost efectuată pe filme folosind programul NIH Scion image (Scion Corporation, Frederick, MD, SUA).

Analiza concentrațiilor de crom

analize statistice

Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SEM. Diferențele dintre cele două grupuri au fost analizate prin testul t pentru comparație. Un test anova urmat de testul Bonferroni post hoc a fost utilizat pentru a determina diferențele atunci când au fost analizate mai mult de două grupuri. O valoare P mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă. Testul exact al lui Fisher a fost, de asemenea, utilizat pentru a evalua semnificația datelor de urgență.

Materiale

Rapamicina provenea de la LC Laboratories (Woburn, MA, SUA). Anticorpii anti-GLUT4, anti-fosfo-S6K, anti-S6K și anti-actină au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology (Beverly, MA, SUA). Reactivii de chemiluminescență îmbunătățiți provin de la Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, SUA).

Rezultate

Efectele HPD asupra indicilor greutății corporale, aportului alimentar/caloric, eficienței alimentelor și nivelurilor serice de leptină

Am hrănit șoareci masculi C57BL6/J cu SD, HFD sau HPD timp de 12 săptămâni. Diferitele aporturi alimentare au condus la diferențe în parametrii metabolici corporali și nivelurile serice de leptină (Figura 1). Greutățile șoarecilor hrăniți cu HPD după 12 săptămâni au fost cu 9 și respectiv 19% mai mici, comparativ cu șoarecii hrăniți cu SD și HFD, ceea ce arată o diferență semnificativă statistic (Figura 1 A). În plus, creșterea în greutate corporală (greutate corporală) a fost semnificativ atenuată la șoarecii alimentați cu HPD cu 40 și respectiv 64%, paralel cu grupul SD și HFD (Figura 1 B). Cu toate acestea, șoarecii hrăniți cu HPD au crescut semnificativ aportul mediu zilnic de alimente (2,59 ± 0,06 vs 2,29 ± 0,04 g pe șoarece zi -1, respectiv, P 1 C), dar aportul caloric zilnic al grupului HPD a scăzut (9,76 ± 0,22 vs. 13,49 ± 0,24 kcal pe zi de șoarece -1, respectiv, P 1 D). Cu toate acestea, aportul zilnic de alimente și aportul caloric zilnic al grupului HPD a fost semnificativ mai mic (P -1 aliment, respectiv P -1 aliment, P 1 E). Leptina este implicată în reglarea aportului alimentar. Șoarecii alimentați cu HPD au demonstrat o scădere semnificativă de 3,2 ori (P 1 F). Acest rezultat este în concordanță cu datele privind consumul de alimente. În plus, nivelurile serice de leptină ale șoarecilor alimentați cu HPD au prezentat o creștere de 1,7 ori (P * P * * P * * * P 2). Cu excepția inimii, splinei și rinichilor, greutățile ficatului și a tampoanelor de grăsime epididimale ale șoarecilor hrăniți cu HPD au fost, de asemenea, semnificativ mai mici decât cele din grupul SD. În raport cu grupul HFD, greutățile ficatului, splinei, RWAT și EWAT la șoarecii hrăniți cu HPD au fost semnificativ mai mici, cu 18, 27, 36 și respectiv 68%, atunci când s-au normalizat pentru greutatea corporală (Figura 2). În plus, ficatul și EWAT ca procente din greutatea corporală la șoarecii hrăniți cu HPD au fost semnificativ reduse, cu 13 și respectiv 31%, în comparație cu greutățile respective din grupul SD. Cu toate acestea, nu s-au găsit diferențe pentru inimă și rinichi ca procent din greutatea corporală între cele trei grupuri.

efectele

Efectele dietei asupra greutății absolute a organelor și a țesutului adipos alb și a greutății tuturor organelor și țesuturilor normalizate pentru greutatea corporală (%) la șoareci după 12 săptămâni de consum ad libitum de SD (23,5% proteine), HFD (16% proteine) )) sau HPD (60% proteine). Toate valorile sunt date ca medie ± SEM, n = 10 pentru toate grupurile. Semnificativ statistic la * P * * P * * * P a, b P 3 A). Această constatare a fost în concordanță cu greutățile mai mici ale tamponului de grăsime observate la animalele hrănite cu HPD, comparativ cu grupurile hrănite cu SD și HFD. Aceste descoperiri indică faptul că HPD a împiedicat acumularea de grăsimi în ficat și acest lucru ar fi putut reduce hipertrofia tampoanelor de grăsime. Mai mult, pentru a determina efectul dietei asupra scorurilor ficatului gras (Figura 3 B), au fost evaluate dimensiunile celulelor adipoase din RWAT (Figura 3 C) și EWAT (Figura 3 D). Aceste rezultate indică faptul că au existat diferențe semnificative între cele trei grupuri. Am observat o scădere de 10 ori de trei ori a scorurilor ficatului gras al șoarecilor hrăniți cu HPD, comparativ cu șoarecii HFD și, respectiv, hrăniți cu SD. Nivelurile de expresie pentru dimensiunea medie a adipocitelor au arătat că adipocitele la șoarecii hrăniți cu HPD au fost în mod constant mai mici comparativ cu cele din grupul hrănit cu HFD, cu scăderi medii ale dimensiunii de 86 și 85% pentru tampoanele de grăsime retroperitoneală și respectiv epididimală. În plus, dimensiunile adipocitelor din RWAT și EWAT în grupul alimentat cu HPD au fost, de asemenea, mai mici decât cele din grupul alimentat cu SD, cu scăderi medii de 53 și respectiv 33%. Astfel, HPD a avut un efect preventiv mai mare asupra hipertrofiei celulelor grase decât SD.

Fotomicrografii ale probelor de țesut adipos alb, hepatic, retroperitoneal și epididimal colorate cu hematoxilină și eozină, scoruri hepatice grase (B), (C) celularitatea adipocitară a RWAT și (D) celularitatea adipocitară a EWAT de la șoareci după 12 săptămâni de consum ad libitum fie de SD (23,5% proteină), HFD (16% proteină) sau HPD (60% proteină). Toate valorile sunt date ca medie ± SEM, n = 9-11 pentru toate grupurile. Toate fotomicrografiile au fost determinate ca mărire pentru analiza histologică (× 400). Semnificativ statistic la * P * * P * * * P 4 A). În mod remarcabil, toleranța la glucoză și nivelurile de glucoză din sânge la 0, 30, 60 și 120 min au fost semnificative (P 4 B). Folosind criteriul intoleranței la glucoză ca un nivel al glicemiei peste 900 mg · L -1 la 120 min post-i.p. injectarea glucozei, am constatat că o fracțiune semnificativă a șoarecilor de pe HPD și SD au prezentat o intoleranță mai mică la glucoză decât șoarecii hrăniți cu HFD (P 4 C). Concentrațiile serice de insulină au prezentat o diferență semnificativă între cele trei grupuri. Șoarecii hrăniți cu HPD au avut niveluri mai mici de insulină decât cei hrăniți cu HFD (P 4 D). Astfel, șoarecii hrăniți cu HPD au prezentat homeostazie normală a glucozei cu hipoinsulinemie.

Efectele dietei asupra (A) testului de toleranță la glucoză: 1 g · kg -1 de glucoză, (B) ASC în timpul celor 120 de minute după injectarea glucozei, (C) criteriul de intoleranță la glucoză (testul exact al lui Fisher) și (D) insulina serică niveluri la șoareci după 12 săptămâni de consum ad libitum de SD (23,5% proteină), HFD (16% proteină) sau HPD (60% proteină). Toate valorile sunt date ca medie ± SEM, n = 10 pentru toate grupurile. * P * * P * * * P ### P 5 A). Administrarea de rapamicină a avut ca rezultat o semnificativă (P 5 B). Folosind un criteriu de intoleranță la glucoză ca un nivel al glicemiei peste 900 mg · L -1 la 120 min post-i.p. injectarea glucozei, am constatat că o fracțiune semnificativă a șoarecilor tratați cu rapamicină a prezentat intoleranță la glucoză (P 5 C). Cu toate acestea, șoarecii tratați cu rapamicină au avut niveluri serice mai ridicate de insulină (P 5 D). Astfel, șoarecii slabi care au primit rapamicină au dezvoltat simptome de diabet, cu hiperglicemie, hiperinsulinemie și intoleranță la glucoză.

Efectul rapamicinei asupra testului de toleranță la glucoză (A): 1 g · kg -1 de glucoză, (B) ASC în timpul celor 120 de minute după injectarea glucozei, (C) criteriul intoleranței la glucoză (testul exact al lui Fisher) și (D) insulinei serice nivelurile au fost măsurate de la șoareci slabi tratați cu vehicul sau rapamicină timp de 35 de zile. Toate valorile sunt date ca medie ± SEM, n = 12 pentru toate grupurile. * P * * * P 6 A) și, respectiv, indicele de sensibilitate la insulină (Figura 6 B). Pentru a caracteriza în continuare mijloacele prin care transportul glucozei este redus după inhibarea mTOR, am evaluat efectul rapamicinei asupra expresiei transportorului de glucoză. Comparativ cu grupul martor, tratamentul cu rapamicină în mod dramatic (P 389), utilizat ca un marker specific al activității mTOR, care este caracterizat patologic în dezvoltarea diabetului (Dann și colab., 2007; Chang și colab., 2009b). De asemenea, am constatat că expresia GLUT4 în mușchi a fost semnificativ (P 6 C).

Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Semnificativ statistic la