doi: 10.18527/2500-2236-2019-6-1-28-36

celular

primit: 2018-12-30 admis: 2019-03-13 publicat: 2019-06-10

Oleg P. Zhirnov 1,2, Tatyana E. Konakova 1, Darisuren Anhlan 3, Stephan Ludwig 3, Elena I. Isaeva 1

1 N. F. Gamaleya Institutul de Cercetări Științifice de Epidemiologie și Microbiologie, Moscova, Federația Rusă
2 Academia rus-germană de științe medicale și biotehnologice, Moscova, Federația Rusă
3 Institutul de virologie, Westphalian Wilhelm University Münster, Münster, Germania
# Autor corespondent: Oleg Zhirnov, e-mail: [email protected]

Abstract

Introducere

Virusul gripal A (familia Orthomyxoviridae, genul alfainfluenzavirus) este un virus învelit cu un genom ARN care are o strategie de sens negativ pentru replicare și exprimare în celulele infectate. Genomul virusului este format din 8 segmente de ARN cu sens negativ; fiecare dintre ele servește drept șablon pentru sinteza (transcrierea) ARNm-urilor cu sens pozitiv, care sunt traduse în celulele infectate pentru a produce 16 proteine ​​virale, folosind splicing și o schimbare de cadru translațional [1, 2]. Al optulea segment de ARN NS codifică două proteine ​​prin intermediul strategiei clasice în sens negativ - proteina nestructurală NS1 (27 kDa), care este un antagonist al interferonului activ (IFN) și proteina de export nuclear NEP (14 kDa) [1].

S-a raportat anterior că o cale alternativă pentru sinteza celei de-a treia proteine ​​virale prin traducerea directă a ARNv cu sens negativ al virionului este codificată în segmentul NS așa cum se arată în Fig. 1 [3-5]. Un cadru de lectură deschis (ORF) pentru o proteină virală suplimentară, așa-numita proteină cu catenă negativă (NSP), a fost identificată în segmentul NS al majorității covârșitoare a virusurilor gripei A umane [6]. Un studiu al evoluției genei NSP de-a lungul timpului prin metoda analizei multi-metrice a variabilității genei în diferite tulpini virale a arătat că gena NSP a apărut într-o populație de virusuri gripale A umane la începutul secolului al XX-lea [6]. În marea majoritate a virusurilor gripei A aviare, gena NSP din segmentul NS este blocată de o serie de codoni de oprire aiurea. Pe baza analizei structurii primare a genei NSP a diferitelor tulpini de virus, proteina corespunzătoare poate fi considerată transmembranară, deoarece are două domenii hidrofobe distincte la termenii N și C ai moleculei de polipeptidă și un site de N-glicozilare [4].

Pentru a verifica această ipoteză, am investigat formarea limfocitelor specifice peptidei NSP82-119, după dubla infecție a șoarecilor cu virus gripal A.

Materiale și metode

Viruși

Virusul gripal A/WSN/33 (H1N1) și reasortantul virusului A/Aichi/2/68 (H3N2) cu A/WSN/33, conținând un segment NS din virusul A/WSN/33 și restul genelor din A/Aichi/2/68 (H3N2) (denumit A/Aichi/2/68-WSN) au fost utilizate în acest studiu. Reasortantul A/Aichi/2/68-WSN (H3N2) a fost obținut prin metoda reasortării la Institutul de Cercetare Științifică Gamaleya de Epidemiologie și Microbiologie. Ambii virusuri s-au propagat în cavitatea alantoică a embrionilor de pui în vârstă de 9 zile.

Titrarea virusului

Titrul infecțios al virușilor a fost determinat de metoda de formare a focarelor infecțioase în celulele rinichiului canin Madin Darby (MDCK), așa cum a fost descris anterior [6]. Activitatea infecțioasă a preparatelor virale a fost exprimată în unități de formare a focalizării (FFU).

Producerea de proteine ​​NSP recombinante în celulele bacteriene

Infecția șoarecilor cu virusuri gripale A.

Fracționarea leucocitelor din splina șoarecilor infectați cu virusul gripal

Splina fiecărui șoarece a fost întreruptă mecanic pentru a obține o singură suspensie celulară și a fost clarificată prin centrifugare la 170 g timp de 10 min (rotor Eppendorf 5804/R, FL 100). Nivelul de celule viabile din supernatant nu a fost mai mic de 80% în funcție de colorarea cu albastru tripan. Celulele de la fiecare șoarece au fost adăugate la o placă cu 96 de godeuri în cantitate de 1,1-1,6 x 106 celule/godeu și cultivate timp de 24 de ore la 37 ℃ în mediu RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Gibco BRL) . Apoi, preparatele studiate: peptida NSP82-119 (1 µg/ml), proteina NSP (2,5 µg/ml), sau virusul A/Aichi/2/68-WSN (H3N2) cu multiplicitatea infecției de 0,01 FFU/celulă au fost adaugate. La celulele martor a fost adăugată albumina serică bovină (BSA) cu concentrația finală de 3 μg/ml. După incubarea ulterioară timp de 20 de ore, celulele din fiecare godeu au fost recoltate și peletizate. ARN a fost izolat din pelete urmat de analiza nivelului de ARNm IFNy și ARN ribosomal 28S utilizând PCR în timp real (RT-PCR).

Determinarea nivelului IFNγ în leucocite prin RT - PCR

Exemplu de atribuire

Exemplu de structură

1. Exemplu pentru sinteza fragmentului de ARN 28S (F)

2. Exemplu pentru sinteza fragmentului de ARN 28S (R)