Affiliation School of Biosciences, Universitatea din Nottingham, Sutton Bonington, Loughborough, Regatul Unit

ciclului

Affiliation School of Biosciences, Universitatea din Nottingham, Sutton Bonington, Loughborough, Regatul Unit

Afiliere Rowett Institute of Nutrition and Health, Universitatea din Aberdeen, Aberdeen, Regatul Unit

Afiliere Rowett Institute of Nutrition and Health, Universitatea din Aberdeen, Aberdeen, Regatul Unit

Afiliere Rowett Institute of Nutrition and Health, Universitatea din Aberdeen, Aberdeen, Regatul Unit

Affiliation School of Biosciences, Universitatea din Nottingham, Sutton Bonington, Loughborough, Regatul Unit

  • Angelina Swali,
  • Sarah McMullen,
  • Helen Hayes,
  • Lorraine Gambling,
  • Harry J. McArdle,
  • Simon C. Langley-Evans

Cifre

Abstract

Multe mecanisme presupun explicarea modului în care semnalele nutriționale din timpul dezvoltării timpurii se manifestă ca boală la descendenții adulți. În timp ce acestea descriu procesele care conduc de la insulta nutrițională la dezvoltarea patologiei reale, cauza inițială care stă la baza efectului de programare rămâne evazivă. Pentru a stabili principalele motoare de programare, acest studiu a urmărit să capteze modificările embrionare ale genelor și proteinelor în întregul embrion în momentul insultei nutriționale, mai degrabă decât efectele fenotipice din aval. Prin utilizarea unui design încrucișat a două modele bine stabilite de restricție a proteinelor materne și a fierului, ne propunem să identificăm „purtătorii de poartă” comuni putabili care pot conduce la programarea nutrițională.

Atât carența de proteine, cât și cea de fier în utero au redus complementul nefronic la șobolanii masculi adulți Wistar și Rowett Hooded Lister (P2 Profiler PCR Array for Rat Cell Cycle (SABiosciences) a fost efectuată ca validare ulterioară în aceste patru grupuri. 500 ng de ARN embrionar preparat anterior din grupurile RHL (CP, MLP, FeC și FeD; n = 6 pentru fiecare) a fost transcris invers utilizând un kit RT 2 First Strand (SABiosciences). PCR în timp real a fost efectuat pe ADNc în amestec verde SYBR în plăci matrice de 384 de godeuri personalizate să analizeze expresia a 84 de gene cheie pentru reglarea ciclului celular și gene de menaj.

Proteomica.

Analize statistice.

Numărul total de nefron, modificările expresiei genelor și aria și densitatea spotului proteic au fost comparate între grupurile de dietă/tulpină prin ANOVA unidirecțională în SPSS v16.0. În cazul unui rezultat semnificativ ANOVA (P Tabelul 1. Greutatea la naștere la bărbați, greutatea corporală de 16 săptămâni, greutatea renală stângă de 16 săptămâni și raportul greutate rinichi-corp.

La ambele tulpini de șobolani, proteine ​​prenatale (Wistar: P Figura 1. Numere de nefron în fiecare dietă/grupă de tulpini.

Datele sunt medii ± SE. * P Tabelul 2. Numărul de gene reglate în sus și în jos cu fiecare insultă dietetică comparativ cu controlul său, în fiecare tulpină de șobolan (n = 8 animale pe grup; RHL - Rowett Hooded Lister, MLP - proteine ​​scăzute materne, FeD - deficit de fier).

Analiza căii.

Analiza căii a fost efectuată folosind platforma MetaCore pentru a identifica procesele funcționale care au fost perturbate de expunerea embrionului la subnutriția maternă. Această analiză s-a bazat exclusiv pe genele supuse gatekeeper identificate din microarrays (Tabelul S2a - d). Nu au existat suficiente gene Wistar gatekeeper specifice pentru a găsi căi comune restricțiilor de proteine ​​și fier prenatale în această tulpină. Cu toate acestea, pentru RHL, cele mai semnificative căi s-au referit la remodelarea citoscheletului, procesele ciclului celular, apoptoza, transducția semnalului, metabolismul glicogenului și procesele de dezvoltare (Figura S1a). Ambele tulpini de șobolan expuse restricției prenatale de proteine ​​au împărțit căi preocupate de semnalizarea fantei-robo, formarea veziculelor acoperite cu clatrin, aderența celulară și din nou remodelarea citoscheletului (Figura S1b). Pentru deficitul de fier, ambele tulpini de șobolan au prezentat modificări ale căilor comune în conformitate cu cele raportate pentru RHL și restricția proteinelor (formarea veziculelor acoperite cu clatrin, remodelarea citoscheletului, aderența celulelor și procesele de dezvoltare), pe lângă formarea endosomilor, transcripția, contracția musculară și imunitatea răspuns (Figura S1c).

Analiza căilor a identificat, de asemenea, factori de transcripție care au format „hub-uri” în căile comune. O listă a fost construită din gene asociate cu aceste hub-uri și acest lucru a fost încrucișat cu lista genelor identificate ca putative gatekeepers din microarray. Un total de 36 de gene au apărut pe ambele liste și acestea au fost considerate cele mai importante ținte genetice pentru activitatea de urmărire. În plus, au fost selectați ca ținte 4 factori de transcripție care au format „hub-uri” importante în analiza căii.

PCR în timp real.

Analiza PCR în timp real a celor 36 de ținte genetice și a 4 factori de transcripție identificați în analiza microarray și a căilor nu a reușit în general să demonstreze semnificația statistică a rezultatelor microarray, deși modificările au arătat un acord general (tabelele 3 și 4). Dintre cele treizeci și șase de gene selectate, șaisprezece s-au arătat prin PCR că sunt reglate în sus sau în jos cu aceeași direcție de schimbare indicată de microarray, în ambele insulte dietetice într-o tulpină sau aceeași insultă în ambele tulpini. Dintre acestea, o genă, Ube2c, a demonstrat o descreștere semnificativă (aproximativ 50%) atât pentru restricția de fier, cât și de proteine ​​la embrioni din sarcinile cu RHL. Alte patru dintre aceste șaisprezece gene (Acvr2b, Nufip1, Rps20 și Taf13) au prezentat modificări semnificative între una dintre cele două perechi din grup. De exemplu, Nufip1 a fost semnificativ reglat în jos în MLP vs CP în RHL (P Tabelul 3. Exprimarea selecției genelor de microarray în țesutul embrionar analizat prin PCR în timp real ca răspuns la deficiența de fier atât la șobolanii Wistar, cât și la cei de la Rowett Hooded Lister (FC = schimbare ori, RHL = Rowett Hooded Lister).

Șaisprezece din cele treizeci și șase de gene au fost de acord cu microarray-ul pentru una dintre perechile din grup, două semnificativ, dar au arătat direcția opusă de schimbare în cealaltă pereche (din nou, o verificare parțială a studiului microarray). Doar patru din cele treizeci și șase de gene au prezentat modificări de expresie care se aflau în direcția opusă microarrayului (Cyclin H, Mcart1, TBX3 și Tomm20). Patru gene (Eef1g, Hint1, Rnf7 și Stx12) au fost sugerate prin analiza PCR în timp real pentru a fi gatekeeperi pentru un grup diferit de cel identificat inițial prin microarray (RHL gatekeepers, mai degrabă decât restricții de fier gatekeepers). Două dintre acestea (Hint1 și Rnf7) au prezentat acum modificări semnificative între RHL CP și MLP. Cei patru factori de transcripție care au fost selectați din analiza căii și măsurați prin PCR în timp real (SP1, C-Myc, HNF4a și p53) au arătat toți modificări unidirecționale în expresie, atât cu insulte dietetice la șobolani RHL, cât și modificări ale expresiei abordate semnificație statistică pentru cel puțin una dintre insultele dietetice în fiecare caz (P Tabelul 5. Selectarea datelor privind expresia genelor din RT 2 Profiler Rat Cell Cycle PCR Array (FC = fold-change, RHL = Rowett Hooded Lister).

Proteomica.

În mod similar cu analiza microarray, analiza proteomică nu a identificat proteine ​​exprimate diferențial atât pe tulpini, cât și pe diete. Cu toate acestea, 9 proteine ​​au fost exprimate la niveluri semnificativ diferite, atât cu diete la șobolani Wistar, cât și cu 8 la șobolani RHL (Tabelul 6). Unele dintre proteinele identificate au fost legate de aceleași procese care au apărut în urma analizelor matrice genetice. În mod deosebit, acestea au inclus funcții cito-scheletice (proteina 3 legată de actină și lanțul α-1 al tubulinei) și degradarea proteinelor prin proteazomul 26 (proteasomul SUG1 și 26S tip 1). Acesta din urmă a fost un proces comun atât restricției de proteine, cât și de fier la ambele tulpini de șobolan.

Discuţie

Din câte știu autorii, acesta este primul studiu care folosește o abordare încrucișată multi-tulpină și multi-dietă pentru a identifica mecanisme moleculare comune prin care restricțiile nutriționale materne diferite pot exercita efecte similare de programare nutrițională pe termen lung. A fost selectată o perioadă critică pentru insultele nutriționale, care au corespuns dezvoltării proceselor renale și cardiovasculare cheie, cum ar fi formarea metanefrosului, controlul tensiunii arteriale și dezvoltarea extinsă a sistemelor vasculare și renale [22], [23],] . Spre deosebire de multe alte studii din domeniu, modificările genomice și proteomice au fost surprinse în embrion, în momentul real al insultei și al stimulilor de programare inițială, mai degrabă decât mai târziu în viață, când efectele secundare pot masca mecanismele primare. Scopul studiului a fost de a identifica genele și proteinele gatekeeper și căile și procesele asociate care pot conduce la răspunsul de programare la insulta nutrițională. Rezultatul nou al lucrării a fost o serie diversă de dovezi care să susțină ideea că reglarea ciclului celular, remodelarea citoscheletală și degradarea proteinelor sunt ținte cheie pentru programarea insultelor.

Prima secțiune a studiului a arătat că hrănirea șobolanilor însărcinați cu o dietă deficitară fie în proteine, fie în fier până la jumătatea gestației a dus la o afectare a dotării cu nefron la descendenții lor masculi adulți, în ambele tulpini studiate. Astfel, am demonstrat un fenotip comun programat, care este în concordanță cu rapoartele noastre anterioare că ambele insulte dietetice induc hipertensiune la șobolani [4], [5]. Acest lucru a avut loc în absența unor modificări ultrastructurale la descendenții șobolanilor cu restricție proteică și deducem că subnutriția are impact asupra nefrogenezei (adică evenimentele timpurii), mai degrabă decât prin leziuni ale structurilor existente care apar ca răspuns la caracteristicile fenotipice secundare, cum ar fi creșterea tensiunii arteriale [25]. ].

Cel mai semnificativ proces observat a fi perturbat de expunerea la ambele diete la șobolanii RHL și la ambele tulpini cu deficit de fier sau cu deficit de proteine, a fost remodelarea citoscheletală. Cele două componente principale ale citoscheletului sunt actina și tubulina, care au fost identificate ca ținte gatekeeper exprimate diferențial prin microarray și respectiv proteomică, împreună cu complexul proteinei actin (Arp) 2 și 3. Dinamica citoscheletală este controlată parțial de semnalizarea Slit-Robo prin reglarea GTPazelor familiei Rho, ambele identificate ca căi semnificative în analizele noastre. Șoarecii lipsiți de gene pentru Slit sau Robo suferă defecte renale fatale la scurt timp după naștere [27]. Având în vedere celelalte constatări ale analizei căilor și ale matricei axate pe ciclul celular, asocierea citoscheletului cu reglarea ciclului celular este probabil de o semnificație mai mare. Integritatea corectă a citoscheletului și a complexului Arp 2/3 sunt necesare pentru a asigura asamblarea corectă a fusului mitotic și pentru a permite progresia prin punctul de control G2 al ciclului celular și pentru a iniția mitoza [28].

Mai multe gene (Xbp1, Tomm34, NRF-1) care au fost reglementate diferențial de dieta maternă joacă un rol important în procesele ciclului celular. Controlul ciclului celular și menținerea integrității ADN-ului s-au dovedit a fi perturbate în urma restricției proteinelor in utero, măsurată prin microarray în țesutul hepatic nou-născut (Clark, Langley-Evans, Bogdarina și Altobelli, observație nepublicată). Din aceste motive, o serie de cicluri celulare specifice căii a fost efectuată pe probele de embrioni, pentru a evalua impactul general al subnutriției asupra reglării ciclului celular într-un mod imparțial. Matricea PCR a evidențiat faptul că ciclul celular a fost afectat în special de restricția proteinelor. Mai exact, păreau a fi punctele de control mitotice care erau cele mai vulnerabile la efectele subnutriției. Primul punct de control este situat la sfârșitul fazei G1, restricționând intrarea în faza S dacă condițiile de mediu fac imposibilă diviziunea celulară. Pmp22 și Apbb1, reglate în mod semnificativ în embrionii MLP în analizele matricei PCR, sunt în mod normal responsabili de reglarea negativă a fazei S prin inducerea apoptozei. Reglarea descendentă a acestor gene și a altora la punctul de control G1 poate permite ADN-ului deteriorat să progreseze pe parcursul ciclului.

Urmărirea țintelor genetice cheie a fost efectuată postnatal, în special în țesutul renal, spre deosebire de întregul genom. PCR-urile au arătat că expresia se afla într-o stare de flux între perioadele embrionare și postnatală timpurie. Factorii de transcripție care au fost compromis în timpul dezvoltării embrionare au suferit o supra-exprimare compensatorie sau o reglare descendentă pe parcursul creșterii și dezvoltării timpurii. Acest lucru evidențiază faptul că studiile care încearcă să descopere consecințele manipulării nutrienților în timpul vieții fetale la un moment postnatal se vor confrunta cu probleme cu sensibilitatea calendarului lor și alegerea țesutului de interes. Acesta este un rezultat important al studiului care ar trebui să fie recunoscut de alții din domeniu.

În timp ce evaluarea țintelor de microarray de către PCR nu a rezultat întotdeauna într-o amploare și o semnificație similare a schimbărilor de expresie, trebuie remarcat că anchetatorii încep doar să abordeze problemele cu privire la criteriile care constituie o verificare satisfăcătoare a unui rezultat de microarray [33]. Aceasta este recunoscută ca o problemă specială în studiile nutriționale, unde se poate aștepta ca efectele să fie mici. Atât tehnicile bazate pe matrice, cât și pe PCR sunt considerate a avea propriile avantaje și dezavantaje și pot fi utilizate mai bine împreună ca studii complementare, mai degrabă decât să considerăm rezultatul PCR ca validare a matricei [34]. Această abordare a fost adoptată în experimentul actual și o forță majoră a acestui studiu constă în analize de putere atente care au asigurat dimensiunea optimă a eșantionului și robustețea biologică.

Acest studiu are o importanță majoră pentru înțelegerea mecanismelor biologice de bază care stau la baza programării dezvoltării, datorită designului său experimental complet și unic. Folosind un număr mare de eșantioane, a permis o evaluare sistematică a proteinelor embrionului întreg și a modificărilor expresiei genelor care apar în comun în două modele stabilite și, în mod crucial, în timpul unei perioade critice de dezvoltare a organelor în viața fetală. O serie de mecanisme sunt deja bine caracterizate pentru a explica modul în care semnalele nutriționale din viața timpurie promovează un risc crescut de boală. În timp ce aceste studii sunt toate importante, ele caracterizează procesele care mediază patologia din aval sau consecința metabolică a programării, mai degrabă decât baza reală a răspunsului programat în sine. Am identificat influențele nutriționale asupra proceselor fundamentale care vor avea un impact asupra tipului celular și numărului funcțional din țesuturi ca o caracteristică centrală a programării timpurii a vieții. Aceste descoperiri pot deschide acum ușa abordării vizate pentru a confirma procesele implicate și dezvoltarea de noi strategii de prevenire și tratament a bolilor. Lucrările ulterioare de investigare a organelor sau țesuturilor specifice în care au loc modificări ale expresiei genelor și proteinelor sunt justificate.

informatii justificative

Figura S1.

Hărți ale căilor Go semnificative statistic de la GeneGo. Procesele sunt clasificate pe baza valorii p. Barele reprezintă jurnalul invers al valorii p. S1A: Căi semnificative GeneGo comune atât restricției prenatale cât și restricției de fier la șobolanii RHL. S1B: Căi semnificative GeneGo comune restricției prenatale a proteinelor atât la șobolanii Wistar, cât și la șobolanii RHL. S1C: Căi GeneGo semnificative comune restricției de fier prenatale atât la șobolanii Wistar, cât și la șobolanii RHL.

Tabelul S1.

Ultrastructură podocitară măsurată din imagini de microscopie electronică. Date exprimate ca medie ± SEM. GBM- membrana bazală glomerulară.

Tabelul S2.

Tabelul S3.

Determinarea în timp real a PCR a expresiei genei țintă gatekeeper în țesutul renal postnatal. (W P = Wistar Proteins, W Fe = Wistar Irons, RHL P = Rowett Hooded Lister Proteins, RHL Fe = Rowett Hooded Lister Irons; FC = fold-change.)

Tabelul S4.

Date de expresie genică pentru matricea PCR a ciclului de celule de șobolan RT 2. (FC = fold-change, RHL = Rowett Hooded Lister.)

Mulțumiri

Autorii doresc să le mulțumească doamnei Carol Armett, dlui Richard Plant și domnișoarei Sarah Kirkland (UoN) pentru îngrijirea animalelor, iar Emma King de la Universitatea din Nottingham Advanced Microscopy Unit a oferit asistență valoroasă cu TEM. Gary Rucklidge și Martin Reid au efectuat analiza proteomică, iar Graham Horgan și Louise Cantlay au fost implicați în interpretarea datelor.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: SM SCL-E HJM LG. Experimentele efectuate: AS SCL-E. Analiza datelor: AS SCL-E HH LG. A scris lucrarea: AS SCL-E SM.