Tiejun Li și Yulong Yin

furaje

Laboratorul cheie al proceselor agroecologice în regiunea subtropicală,

Institutul de Agricultură Subtropicală, Academia Chineză de Științe, Hunan (China)

E-mail [email protected]; [email protected]

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

Abstract

Introducere

Restricția dietetică este un potențial terapeutic promițător pentru prevenirea bolilor legate de îmbătrânire și extinderea perioadei de sănătate prin medierea comportamentului alimentar și reprogramarea metabolică, în special pentru restricția proteinelor [1-4]. Lizina servește drept element cheie pentru sinteza proteinelor și a fost clasificată ca aminoacid esențial la oameni și animale [5-7]. În studiile anterioare, am folosit o dietă cu deficit de lizină formulată cu zeină și am constatat că deficitul de lizină a inhibat aportul de hrană și a influențat absorbția intestinală și metabolismul aminoacizilor la șoareci și purcei [8, 9]. Acest studiu a fost una dintre primele încercări de a investiga dacă limitarea lizinei corespunde rolului benefic al restricției proteice.

Materiale și metode

Animale și grupuri

18 purcei masculi (Landrace × Large White) cu greutatea corporală medie (21,26 ± 0,39 kg) au fost împărțiți în mod aleatoriu în 6 pixuri triunghiulare (Fig.1A) (n = 3) cu trei jgheaburi în fiecare colț. Trei diete de lizină (70%, 100% și 130%) conform NRC 2012 (Tabelul 1) au fost hrănite în fiecare jgheab, iar ordinea de hrănire și jgheaburile de hrănire ale dietelor au fost schimbate în fiecare zi într-o ordine fixă. Animalele erau libere să bea apă și hrănite de 6 ori pe zi timp de 25 de zile. Aportul de furaje în fiecare jgheab a fost înregistrat zilnic pentru a evalua preferințele dietetice pentru dietele care variază în concentrația de lizină.

tabelul 1.

Compoziția și nivelul nutrienților din dieta bazală. * Premixul a furnizat următoarele pe kilogram de dietă: Sepiolit, 6.043g; vitamina porcului, 750 mg; FeSO4 · H2O, 516mg; CuSO4 · 5H2O, 600 mg; MnSO4 · H2O 250mg; ZnSO4 · H2O, 212mg; Na2SeSO3, 30 mg; CoO 500 mg; VB4 1000mg; ZnO 60mg; KI 39mg; DE, energie digestivă

FIG. 1.

Cantitativ în timp real (RT-PCR)

ARN-ul total din probele de jejun și ileon a fost izolat din țesuturile azotate congelate și măcinate cu regiz TRIZOL (Invitrogen, SUA) și apoi tratate cu DNază I (Invitrogen, SUA) [21-23]. Transcrierea inversă a fost efectuată la 37 ° C timp de 15 minute, 95 ° C 5 sec. Primerii utilizați în acest studiu au fost proiectați prin Exemplul 5.0 în conformitate cu secvența genei de șoareci și porci (Tabelul 2). β-actina a fost aleasă ca genă de menaj pentru normalizarea nivelurilor genei țintă. Starea ciclului PCR a fost de 36 cicluri la 94 ° C timp de 40 sec, 60 ° C timp de 30 sec și 72 ° C timp de 35 sec. Expresia relativă a fost exprimată ca raport dintre gena țintă și gena martor utilizând formula 2 - (∆∆Ct), unde tratamentul ∆∆Ct = (CtTarget -Ctβ-actin) - (CtTarget -Ctβ-actin) control. Expresia relativă a fost normalizată și exprimată ca raport cu expresia din grupul de control [24-26].

masa 2.

Grunduri utilizate în acest studiu. F, înainte; R, invers

Izolarea și caracterizarea microbiotei

ADN-ul total al genomului din digestia ileală a fost extras folosind QIAamp DNA Stool Mini Kit și concentrația și puritatea ADN-ului au fost monitorizate pe geluri de agaroză 1%. Conform concentrației, ADN-ul a fost diluat la 1ng/μL folosind apă sterilă. Genele ARNr 16S din regiuni distincte (16SV3-V4) au fost amplificate folosind un exemplu specific cu codul de bare. Toate reacțiile PCR au fost efectuate cu Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). Se amestecă același volum de tampon de încărcare 1X (conținut verde SYB) cu produse PCR și se operează electroforeza pe gel de agaroză 2% pentru detectare. Probele cu bandă principală strălucitoare între 400-450bp au fost alese pentru alte experimente. Apoi, amestecul de produse PCR a fost purificat cu Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Germania).

Bibliotecile de secvențiere au fost generate folosind TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit (Illumina, SUA) în urma recomandărilor producătorului și au fost adăugate coduri de index. Calitatea bibliotecii a fost evaluată pe fluorometrul Qubit @ 2.0 (Thermo Scientific) și sistemul Agilent Bioanalyzer 2100. În cele din urmă, biblioteca a fost secvențiată pe o platformă IlluminaHiSeq2500 și au fost generate citiri de 250 bp. Secvențe brute sunt disponibile în NCBI SRA cu numerele de acces PRJNA376081.

Analiza microbiomului

Profilarea funcțională predictivă a comunităților microbiene

OTU-urile au fost utilizate în continuare pentru predicția genomului comunităților microbiene de către PICRUSt (Investigarea filogenetică a comunităților prin reconstrucția statelor neobservate) [27]. PICRUSt ia un tabel OTU de intrare care conține identificatori care se potrivesc cu sfaturi de la gena marker (de exemplu, identificatori greengenes) cu abundențe corespunzătoare pentru fiecare dintre aceste OTU pe una sau mai multe probe. În primul rând, PICRUSt normalizează tabelul OTU prin predicțiile numărului de copii 16S, astfel încât abundențele OTU să reflecte mai exact adevăratele abundențe ale organismelor subiacente. Metagenomul este apoi prezis prin căutarea conținutului pre-calculat al genomului pentru fiecare OTU, înmulțind abundența normalizată a OTU cu fiecare abundență KEGG din genom și însumând aceste abundențe KEGG împreună pe probă. Predicția produce un tabel al abundențelor KEGG pentru fiecare probă de metagenom din tabelul OTU. Pentru predicții opționale specifice organismului, abundențele per organism sunt reținute și adnotate pentru fiecare KEGG. În acest studiu, s-au obținut 6, 079 abundențe de KEGG și 5, 41 și 328 de adnotări ale căii KEEG în nivelurile 1, 2 și 3 ale KEEG au fost identificate în arborele de referință Greengenes, respectiv. Ne-am concentrat doar pe nivelul 2 și 3 pentru a investiga răspunsul metagenomului la restricția de lizină din dietă.

Analize statistice

Analiza datelor a fost efectuată utilizând analiza unică a varianței (ANOVA) pentru a testa omogenitatea variațiilor prin testul lui Levene și a fost urmată de testul T al elevului [28] (software IBM SPSS 21.0). Datele sunt exprimate ca medie ± SEN. Valorile din același rând cu * sau # sunt semnificative (P 0,05). În comparație cu dieta de control, restricția lizinei timp de 6 săptămâni a crescut semnificativ intestinal Actinobacterii, Zaharibacterii, și Sinergici abundențe (p 0,05). Fusobacteriile au fost semnificativ îmbunătățite după ce dieta s-a transformat în restricție de lizină (p -3; b, * 10 -5. * Înseamnă că diferența a fost semnificativ comparată cu Lys100; # înseamnă că diferența a fost semnificativă în comparație cu Lys70;% înseamnă că diferența a fost semnificativ în comparație cu Lys100-100; & înseamnă că diferența a fost semnificativă în comparație cu Lys70-70

FIG. 3.

Secvențele bacteriene ARN 16S se reprezintă în probe ileale. Diagramele circulare ale valorilor medii ale abundenței relative (procentul de secvențe) ale celor mai abundente grupuri bacteriene: filum și familie găsite în microbiota ileală (n = 8).

Predicția biofuncțională a comunităților microbiene

În acest studiu, PICRUSt a fost utilizat pentru a analiza profilarea funcțională a comunităților microbiene [27]. Pentru a evalua diferențele globale în abundența KEEG între metagenomi, PCoA a fost generată la nivelul 2 și 3 al KEEG (Fig. 4 A și B). Rezultatele au arătat că metagenomul a fost foarte reglementat ca răspuns la fluctuația lizinei dietetice. La nivelul 2 (Fig. 4C), restricția moderată a lizinei alimentare a afectat în mod semnificativ metabolismul celular și fiziologia, cum ar fi metabolismul aminoacizilor, transportul membranelor, sistemul endocrin, metabolismul carbohidraților, semnalizarea celulară și replicarea și repararea. De exemplu, metabolismul aminoacizilor, transportul membranei și sistemul endocrin au fost îmbunătățite în mod semnificativ în căile KEEG după o dietă dietetică cu restricție de lizină (L70.70) (p