Xiangli Cui

un Departament de Științe Farmaceutice și Biomedice, Facultatea de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Yu Jin

un Departament de Științe Farmaceutice și Biomedice, Facultatea de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Anne B. Hofseth

un Departament de Științe Farmaceutice și Biomedice, Facultatea de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Edsel Pena

b Departamentul de Statistică, Facultatea de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Joshua Habiger

b Departamentul de Statistică, Facultatea de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Alexander Chumanevich

un Departament de Științe Farmaceutice și Biomedice, Facultatea de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Deepak Poudyal

un Departament de Științe Farmaceutice și Biomedice, Facultatea de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Mitzi Nagarkatti

c Departamentul de Patologie și Microbiologie, Școala de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Prakash S. Nagarkatti

c Departamentul de Patologie și Microbiologie, Școala de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Udai P. Singh

c Departamentul de Patologie și Microbiologie, Școala de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Lorne J. Hofseth

un Departament de Științe Farmaceutice și Biomedice, Facultatea de Medicină, Universitatea din Carolina de Sud, Columbia, SC 29208

Date asociate

Abstract

Introducere

Resveratrolul (3,4,5-trihidroxi-trans-stilben) este un compus natural, derivat adesea din tufa japoneză (stufoasă), dar se găsește și în pielea strugurilor roșii și este un component al vinului roșu. S-a demonstrat că resveratrolul prelungește durata de viață a drojdiei și șoarecilor (1). În experimentele murine, au fost raportate anti-îmbătrânire, antiinflamatoare, anti-cancer, anti-neurodegenerative, scăderea zahărului din sânge, chelatoare și alte efecte cardiovasculare benefice ale resveratrolului (2-7). Deși resveratrolul a fost studiat puțin la oameni, acesta pare să aibă efecte cardioprotectoare ex vivo (8, 9). La doze zilnice echivalente cu cantitatea de resveratrol din peste 1000 de sticle de vin roșu, resveratrolul pare a fi sigur (10), dar resveratrolul suferă un metabolism extins la om, ceea ce limitează disponibilitatea moleculei părinte la organele aflate la distanță de locul absorbției. (10). Prin urmare, este deosebit de atrăgător atunci când studiați bolile tractului gastro-intestinal.

S-a demonstrat că resveratrolul suprimă mai multe boli autoimune, inclusiv encefalomielita experimentală (11, 12), artrita (11), miocardita (13) și diabetul (14). Capacitatea resveratrolului de a suprima bolile inflamatorii cronice asociate cu un risc crescut de cancer, cum ar fi boala inflamatorie a intestinului (IBD), a fost explorată doar la șobolani de către un alt grup (15, 16).

IBD constă din două forme de colită ulcerativă (UC) și boala Crohn (CD), care sunt afecțiuni inflamatorii cronice dinamice, idiopatice asociate cu un risc crescut de cancer de colon (17). Tratamentul convențional al colitei poate reduce perioadele de boală activă și poate ajuta la menținerea remisiunii, dar aceste tratamente aduc adesea rezultate marginale, pacienții devin refractari și există efecte secundare. Din acest motiv, mulți bolnavi de colită apelează la tratamente neconvenționale în speranța de a diminua simptomele bolii active și se estimează că 40% dintre pacienții cu IBD utilizează o formă de terapie cu megavitamine a suplimentelor pe bază de plante/dietetice (18, 19). Am arătat recent că Ginkgo biloba (EGb 761) și extractele de ginseng american pot suprima colita la șoareci (20, 21). Datorită proprietăților anti-inflamatorii puternice ale resveratrolului, am emis ipoteza că acest supliment va funcționa și împotriva colitei. Aici, oferim date care susțin astfel de studii, indicând faptul că resveratrolul administrat în dieta bazală suprimă colita indusă de DSS și cancerul de colon asociat cu colita la șoareci.

Metode

Caracteristicile resveratrolului

colita

Țesuturile colorate au fost examinate pentru intensitatea colorării folosind o metodă similară cu cea descrisă anterior (26). Intensitatea colorării în secțiunile tumorale a fost evaluată independent de investigatorii orbi. Pentru fiecare secțiune de țesut, procentul de celule pozitive a fost notat pe o scară de la 0 la 4 pentru procentul de țesut colorat: 0 (0% celule pozitive), 1 (80%). Intensitatea colorării a fost notată pe o scară de la 0 la 3: 0-colorare negativă, 1-colorare slabă, 2-colorare moderată sau 3-colorare puternică. Cele două scoruri au fost înmulțite rezultând o valoare a scorului de imunoreactivitate (IRS) cuprinsă între 0 și 12.

Izolarea celulelor

Analiza citometriei de flux

Celulele din splină, MLN și LP au fost proaspăt izolate așa cum s-a descris mai sus pentru fiecare grup experimental. Selecția celulelor activate prin fluorescență (FACS) celulele colorate cu antigeni de suprafață au fost pre-blocate cu receptori Fc timp de 15 minute la 4 ° C. Celulele au fost spălate cu tampon de colorare FACS (PBS cu 1% BSA), și apoi colorate cu anti-CD3 conjugat CY (145-2C11) și FITC conjugat LY6G (neutrofile) (BD-PharMingen, San Diego CA) timp de 30 de minute . cu agitare ocazională la 4 ° C. Celulele au fost spălate de două ori cu tampon de colorare FACS și resuspendate în soluție BD Cytofix/Cytoperm (BD-PharMingen, San Diego CA) timp de 20 de minute. Din nou, celulele au fost spălate de două ori în soluție BD perm/spălare. Pentru citokinele intracelulare, celulele permeabilizate fixe resuspendate au fost colorate cu anticorpi anti-citokinici conjugați cu flurocrom APC predeterminați (TNF-α, IFN-γ timp de 30 de minute la 4 ° C în întuneric). Limfocitele au fost apoi spălate cu tampon de colorare temeinic FACS și analizate prin citometrie în flux (FC 500 de Beckman Coulter Fort Collins Co).

analize statistice

Cu inflamația ca obiectiv final, s-a făcut o analiză a tabelului de contingență chi-pătrat pe grupele DSS și DSS plus resveratrol pentru a determina dacă a existat o diferență semnificativă statistic în scorurile lor de inflamație. Pentru cuantificarea imunohistochimică, diferențele medii între grupuri au fost comparate prin ANOVA unidirecțională cu teste de comparație multiple Scheffe. Pentru datele de citometrie de flux, diferențele dintre grupuri au fost comparate utilizând testul t al unui student cu două cozi sau un test U-Mann Whitney nepereche. Rezultatele au fost analizate folosind programul statistic Statview II (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) și Microsoft Excel (Microsoft, Seattle, WA) pentru computerele Macintosh. Analiza ANOVA a varianței cu un singur factor a fost utilizată pentru a evalua grupurile respectiv. Incidența tumorii a fost examinată folosind un test exact al lui Fisher, care este echivalent cu un test pentru proporțiile binomiale. Deoarece ipotezele obișnuite care stau la baza testului ANOVA nu sunt îndeplinite, în evaluarea semnificației valorii statisticii F din tabelul ANOVA, în loc să folosim distribuția F, am folosit o distribuție de permutare pentru a examina multiplicitatea tumorii. În cele din urmă, un test neparametric Kruskal-Wallis a fost utilizat pentru a compara volumul mediu al tumorii. Valoarea P aleasă pentru semnificație în acest studiu a fost 0,05.

Rezultate

Resveratrolul atenuează colita indusă de DSS într-o manieră dependentă de doză

Există dovezi din ce în ce mai mari că resveratrolul vizează mulți jucători cheie în inflamație (28, 29). UC este un factor de risc puternic pentru cancerul de colon (17) cu boli inflamatorii cronice asociate cu celule inflamatorii hiperactive care se infiltrează în colon. Pe baza acestor informații, am testat ipoteza că resveratrolul poate suprima colita la șoareci. Pentru a testa această ipoteză, am folosit modelul de colită indus de DSS, cu și fără resveratrol (75 ppm, 150 ppm sau 300 ppm) tratament. Nu am observat nici o caracteristică fenotipică a toxicității (de exemplu, moribund și pierderea în greutate) la nicio doză de resveratrol utilizată în studiile noastre, iar „nivelul observat fără efecte adverse” (NOAEL) pentru speciile murine este de 300 mg/kg/zi). 300 p.m. (cea mai mare doză pe care am folosit-o) este echivalentă cu 42 mg/kg/zi la șoareci, astfel încât această lipsă de toxicitate a fost prezisă.

Figura 1 arată că șoarecii hrăniți cu resveratrol au fost protejați de colita indusă de DSS, la doze de 150 p.p.m. (celule T + p) (în principal celule T CD4 +) din MLN și LP exprimă TNF-α și INF-γ în timpul colitei acute induse de DSS Șoarecii induși de DSS cu colită acută prezintă un număr crescut de celule T CD3 + care exprimă TNF- α și INF-γ în MLN și numărul de celule similare din LP (Figura 2). Cu toate acestea, tratamentul cu resveratrol a redus semnificativ numărul de infiltrate de celule T CD3 + care exprimă TNF-α și INF-γ în MLN și LP cu colită acută după inducția DSS în comparație cu șoarecii martori și/sau șoarecii care au primit DSS singuri (Figura 2). Nu am observat o scădere a numărului de celule T CD3 + splenice care exprimă IFN-γ și/sau TNF- α la șoareci tratați cu resveratrol comparativ cu șoareci induși de DSS Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că tratamentul cu resveratrol reglează TNF-α și INF-γ sistemice care exprimă celulele T în MLN și LP comparativ cu celule similare obținute de la șoareci induși de DSS orice tratament.

Resveratrolul inhibă infiltrarea neutrofilelor la șoarecii induși de DSS

Resveratrolul suprimă markerii inflamației

Pentru a cuantifica în continuare impactul resveratrolului asupra markerilor inflamatori in vivo, am examinat expresia iNOS, COX-2 și TNF-α. Țesuturi din experiment folosind 300 p.p.m. resveratrolul a fost utilizat în aceste scopuri. Colorarea imunohistochimică a fost realizată prin balansarea diapozitivelor folosind amplificatorul de anticorpi (ProHisto, LLC) pentru a asigura o colorare uniformă, consistentă, sensibilă și reproductibilă. Figura 4A prezintă secțiuni reprezentative ale punctului final așa cum este indicat. Figura 4B prezintă cuantificarea fiecărei colorări. În general, nivelurile de iNOS, COX-2 și TNF-α au fost reduse la șoarecii tratați cu DSS care au consumat 300 p.p.m., resveratrol în comparație cu șoarecii tratați cu DSS care consumă o dietă bazală regulată.

Resveratrolul suprimă markerii stresului inflamator

P53 este un biosenzor cheie al stresului inflamator. Deoarece p53 este activat prin fosforilarea la serina 15 în timpul stresului inflamator (33), am cercetat și secțiunile de țesut pentru acești markeri. Figura 5A prezintă secțiuni reprezentative ale punctelor finale așa cum este indicat. Acestea au fost secțiuni în serie ale aceluiași șoareci prezentate în Figura 4A. Figura 5B prezintă cuantificarea colorării. În general, nivelurile de p53 și p53-fosf-serină-15 au fost reduse la șoarecii tratați cu DSS care consumă 300 p.p.m., resveratrol comparativ cu șoarecii tratați cu DSS care consumă o dietă bazală regulată.

Resveratrolul suprimă cancerul de colon asociat cu colita

Multiplicitatea tumorală (numărul de tumori per animal) a scăzut, de asemenea, cu tratamentul cu resveratrol (Tabelul 1). Numărul total de leziuni macroscopice în grupul AOM + DSS a fost de 23, iar numărul total de leziuni macroscopice în grupul de resveratrol AOM + DSS + a fost 2. Analiza distribuției permutărilor a găsit rezultate similare cu cele ale incidenței tumorale. Diferența dintre AOM + DSS (2,4 ± 0,7 tumori per animal) și AOM + DSS + 300 p.p.m. resveratrolul (0,2 ± 0,13 tumori per animal) a fost semnificativ statistic (p 2) a fost scăzut cu tratamentul cu resveratrol (Tabelul 1), această diferență nu a fost semnificativă statistic.

Figura 3A suplimentară sunt secțiuni de colon reprezentative pentru grupul indicat. Figura 3 suplimentară prezintă secțiuni histologice H&E ale fiecărui grup, așa cum este indicat. La evaluarea histologică a tumorilor, am constatat că nu au existat cancere invazive, în concordanță cu alte studii similare (34, 35). În grupul tratat cu AOM + DSS, 25% dintre leziuni erau adenoame cu displazie de grad scăzut, iar 47% erau adenoame cu displazie de grad înalt. Leziunile rămase (28%) au fost carcinom in situ (CSI). În contrast, în AOM + DSS + 300 p.p.m. grupul tratat cu resveratrol mai mult de dublul leziunilor (58%) au fost adenoame cu displazie de grad scăzut, iar mai puține leziuni au fost adenoame cu displazie de grad înalt (16%), precum și CSI (26%). Deși inițial surprinzător că nu s-au observat adenocarcinoame, histologia tumorii variază foarte mult în funcție de mulți factori, inclusiv tulpina șoarecelui (36), condițiile de adăpostire care afectează microflora intestinală (37), precum și regimul de tratament AOM/DSS. Am folosit 1% DSS aici, care este relativ scăzut comparativ cu alte studii, care au folosit până la 4% DSS (38). Un studiu recent pe șoareci C57BL/6 (aceeași tulpină de șoarece folosit aici) folosind 3% DSS, de asemenea, nu a găsit nicio dovadă de adenocarinoame colorectale invazive (35).

Discuţie

Deși s-au înregistrat progrese în tratamentul UC (39), strategiile actuale aduc adesea efecte secundare cu rezultate marginale și au eficacitate specifică populației. Prin urmare, sunt necesare strategii alternative de tratament. Arătăm aici că consumul de resveratrol, un ingredient popular în vinul roșu și pielea strugurilor roșii, este netoxic și capabil să suprime colita la șoareci la 150 p.p.m. și 300 p.p.m. în dietă. Acest lucru este de acord cu un alt grup care a demonstrat că resveratrolul suprimă colita indusă de acidul trinitrobenzenesulfonic (TNBS) la șobolani (15, 16). Resveratrolul în aceste studii a fost administrat prin gavaj oral la 5-10 mg/kg/zi. Prin amestecarea resveratrolului în dieta bazală, am reușit să generăm rezultate similare la șoareci, în acel 150 p.p.m. și 300 p.p.m. (echivalent cu 21 și 42 mg/kg/zi la șoareci; 116 și 232 mg/kg/zi la om) suprimă colita indusă de DSS.

În concordanță cu proprietățile anti-oxidante și antiinflamatorii cunoscute ale resveratrolului, colorarea imunohistochimică pentru iNOS, Cox-2 și TNF-α a fost, de asemenea, redusă la șoarecii care consumă apă cu țepi DSS și consumă resveratrol. Aceste obiective (iNOS, Cox-2 și TNF-α) sunt mediatori cheie ai colitei (40-45). Mecanismul resveratrolului în inhibarea acestor molecule face obiectul unei investigații detaliate suplimentare. Studii recente indică faptul că resveratrolul inhibă translocația nucleară și activarea factorului nuclear kappaB (NF-κB), care reglează transcripțional iNOS și Cox-2 (46-50). În mod similar, suprimarea resveratrolului s-a dovedit a suprima expresia Cox-2 prin blocarea activării protein kinazelor activate de mitogen (MAPK) și a proteinei activatoare -1 (AP-1) (51). Deoarece TNF-α reglează transcripțional iNOS și Cox-2 (52, 53), capacitatea resveratrolului de a inhiba expresia genică a TNF-α (54) poate fi, de asemenea, o legătură mecanicistă între astfel de molecule și suprimarea colitei.

TNF-α crescut este asociat atât cu IBD umană, cât și cu colită murină (32). Rapoartele din alte studii indică faptul că producția de TNF-α joacă un rol important în colita cronică indusă de acidul 2,4,6-trinitrobenzen sulfonic (TNBS) (55). IFN-γ joacă, de asemenea, un rol critic în inducerea și progresia colitei (56). În studiul prezent, am demonstrat că expresia mucoasei și/sau sistemice a TNF-α și IFN-γ a fost redusă prin tratament cu resveratrol la șoareci după inducția DSS. Aceste rezultate sunt în acord cu datele anterioare publicate in vivo și in vitro, unde s-a demonstrat că resveratrolul reduce nivelul citokinelor inflamatorii și al infiltratelor de celule inflamatorii din colon (15, 16, 57, 58).

Stresul inflamator este asociat cu fosforilarea p53 și a serinei 15 și stabilizarea ulterioară a p53 (33). Prin urmare, o altă constatare cheie este că șoarecii care beau apă DSS și consumă resveratrol au suprimat expresia fosforilării p53 și p53-Serine-15. Acest lucru a fost observat în alte boli asociate cu stresul inflamator. De exemplu, resveratrolul suprimă expresia indusă de p53 într-un model de nefropatie diabetică de șobolan (61). Consecințele acestei descoperiri sunt în prezent explorate. De exemplu, este posibil ca p53 să fie o țintă a apoptozei induse de resveratrol sau a senescenței celulelor inflamatorii în timpul colitei. În acest scop, s-a demonstrat că resveratrolul induce apoptoza în celulele canceroase printr-un mecanism mediat de p53 (62). În mod similar, resveratrolul induce oprirea ciclului celular în celulele canceroase de colon HCT 116, dar nu și în omologul lor p53 -/- izogen (63); posibil prin promovarea legării p53 la inhibitorul ciclului celular, p21 (62, 64). Toate studiile sunt în concordanță cu ipoteza că resveratrolul nu numai că induce p53 pentru a conduce apoptoza (65), ci folosește molecula p53 ca nod molecular pentru a induce apoptoza.

Ca o extensie naturală a datelor noastre, aici am efectuat și experimente pentru a determina proprietățile chimiopreventive ale resveratrolului împotriva cancerului de colon determinat de colită. Deși resveratrolul s-a dovedit a fi anterior protector împotriva cancerului de colon (2), din cunoștințele noastre, aceasta este prima dată când s-a demonstrat că resveratrolul reduce tumorigenezele asociate colitei. Acest lucru este în concordanță cu ipoteza că capacitatea resveratrolului de a suprima colita este responsabilă pentru proprietățile sale chemopreventive. Acest lucru nu este surprinzător, având în vedere legătura strânsă dintre inflamație și cancer (66, 67). În general, rezultatele prezentate aici indică faptul că resveratrolul este un agent terapeutic viabil, netoxic pentru tratamentul UC și este un potențial candidat pentru chimioprevenția cancerului de colon la această populație.

Material suplimentar

Figura suplimentară 1. Protocol experimental pentru a testa ipoteza că Resveratrol suprimă colita.