Abstract

Scopuri/ipoteze

Modificările funcției țesutului adipos alb (WAT), inclusiv modificările secreției de proteine ​​(adipokine) și ale compoziției matricei extracelulare (ECM), promovează o stare rezistentă la insulină. Ne-am propus să identificăm noi adipokine reglementate de masa de grăsime corporală în WAT subcutanat uman cu roluri potențiale în funcția adipoasă.

Metode

Au fost combinate datele transcriptomului adipos și profilurile secretome din condiții cu masă WAT crescută/scăzută. Donatorii WAT au fost preponderent femei. Efectele in vitro au fost evaluate folosind proteine ​​recombinante. Rezultatele au fost confirmate prin PCR/ELISA cantitativă, teste metabolice și imunochimie în WAT uman și adipocite.

Rezultate

Am identificat o adipokină necaracterizată până acum, semaforina 3C (SEMA3C), a cărei expresie s-a corelat semnificativ cu greutatea corporală, rezistența la insulină (HOMA de insulină rezistență [HOMAIR] și rata constantă pentru testul de toleranță la insulină [KITT]) și țesutul adipos morfologie (hipertrofie vs hiperplazie). SEMA3C s-a găsit în principal în adipocitele mature și nu a avut niciun efect direct asupra diferențierii adipocitelor umane, lipolizei, transportului glucozei sau expresiei genelor de β-oxidare. Acest lucru ar putea fi parțial explicat prin reducerea semnificativă a receptorilor săi în timpul adipogenezei. În schimb, în ​​pre-adipocite, SEMA3C a crescut producția/secreția mai multor componente ECM (fibronectină, elastină și colagen I) și factori matricelulari (factor de creștere a țesutului conjunctiv, IL6 și factor de creștere transformator-β1). Mai mult, expresia SEMA3C în WAT uman corelat pozitiv cu gradul de fibroză în WAT.

Concluzii/interpretare

SEMA3C este o nouă adipokină reglementată de modificările de greutate. Corelația cu hipertrofia și fibroza WAT ​​in vivo, precum și efectele sale asupra producției ECM în pre-adipocite umane in vitro, sugerează împreună că SEMA3C constituie un semnal paracrin derivat din adipocite care influențează compoziția ECM și poate juca un rol fiziopatologic în WAT uman.

Introducere

Țesutul adipos alb (WAT) este un organ extrem de plastic, care se poate schimba considerabil în dimensiune în interiorul și între persoane. Excesul de masă grasă este asociat cu rezistența la insulină, diabetul de tip 2 și dislipidemia și se corelează cu modificări distincte ale dimensiunii celulelor grase și ale funcției adipoase, inclusiv metabolismul lipidic modificat, creșterea fibrozei interstițiale (datorită producției și depunerii de proteine ​​crescute în matricea extracelulară [ECM] ) și o stare proinflamatorie cronică [1]. Studiile care evaluează efectele pierderii în greutate au demonstrat că, la reducerea masei grase la o stare non-obeză, cele mai multe aspecte ale funcției WAT sunt normalizate [2, 3].

Pentru a menține un profil metabolic sănătos în timpul modificărilor masei grase, sunt necesare mecanisme adaptive care implică semnale între celulele prezente în țesut (de exemplu, adipocite, celule progenitoare adipocite, celule imune și celule endoteliale). Rezultatele din ultimii ani au demonstrat că adipocitele secretă o serie de polipeptide (denumite în mod colectiv adipokine), care, la om, acționează predominant local prin mecanisme auto- sau paracrine. Cu toate acestea, în obezitate producția mai multor adipokine poate fi dezadaptativă și poate promova o stare rezistentă la insulină [4]. Deși au fost efectuate o serie de studii de secretome WAT/adipocite umane, suprapunerea dintre diferite studii este destul de slabă (vezi de exemplu [5-9]). În prezent, se estimează că adipokinomul uman total conține peste 600 de membri, dar lista este încă în creștere.

Metode

Cohorte clinice

Participanții incluși în cohorte sunt descriși, inclusiv referințe relevante, în materialul electronic suplimentar (MES) Tabelul 1. Evaluările clinice au fost efectuate așa cum este descris în referințele relevante. ScWAT abdominal a fost obținut prin biopsii chirurgicale cu ac/ca produs rezidual din proceduri chirurgicale cosmetice, așa cum sa descris anterior [12]. Pentru țesuturile utilizate pentru experimentele de cultură celulară, nu a existat nicio selecție în funcție de vârstă, sex sau IMC. Niciunul dintre participanți nu a luat vreun medicament regulat care ar putea fi de așteptat să afecteze funcția adipocitelor. Cachexia a fost definită așa cum este descris în [13]. IMC a fost clasificat conform definiției OMS. Sindromul metabolic a fost definit în conformitate cu definițiile descrise recent [14] în care au fost utilizate criteriile circumferinței taliei de la Federația Internațională pentru Diabet [15]. Proiectul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare din Declarația de la Helsinki, iar studiile au fost aprobate de Comitetul Regional de Etică din Stockholm, Spitalele Universității din Toulouse, Facultatea a III-a de Medicină din Praga și Spitalul Hôtel-Dieu, Paris. Consimțământul informat individual și scris a fost obținut de la toți participanții implicați în studiu.

Izolarea adipocitelor, cultura celulară și fracționarea țesuturilor

Adipocitele mature și celulele fracției vasculare stroma (SVF) au fost izolate așa cum s-a descris anterior [16, 17]. S-a dovedit că morfologia adipocitelor (adică mărimea relativă a celulelor adipoase în raport cu masa totală de grăsime) se corelează cu sensibilitatea la insulină și a fost determinată așa cum este descris [18].

Populațiile de celule distincte ale SVF au fost izolate folosind un protocol de imunoselecție/epuizare și cultivate așa cum este descris [16, 17, 19-21]. Celulele CD34 +/CD31 au fost definite ca celule progenitoare, celulele CD34 +/CD31 + ca celule endoteliale, celulele CD34 -/CD14 + ca macrofage și CD34 -/CD14 -/CD3 + ca limfocite. Pentru analiza timpului, celulele au fost lizate pentru a obține ARN în ziua 4/5, 8 și 12 după inducerea diferențierii. Pentru analiza secretomului, adipocitele mature și diferitele populații de celule din SVF au fost menținute separat ex vivo la 37 ° C în mediu de cultură bazală endotelială (0,1% BSA) timp de 24 de ore și mediile lor condiționate au fost colectate.

Studii despre transcriptom și secretome

Pentru datele transcriptomului uman, s-au folosit ca punct de plecare seturile de probe identificate ca fiind exprimate diferențial, comparând obezi cu non-obezi în funcție de analiza de semnificație a microarrays-urilor (SAM, rata de descoperire falsă 5%) [22]. Aceste seturi de probe au fost extrase din studiile de slăbire și ulterior analizate cu SAM. Ulterior, s-au calculat mediile de probe reglate semnificativ care corespund aceleiași gene. Acest lucru a generat un set de gene care au fost reglementate de obezitate, precum și de pierderea în greutate voluntară (restricție de energie) și involuntară (cașexia cancerului). Lista a fost filtrată și genele cu o modificare redusă (\ (> _ >>>>> ^ \ \ mathrm >>>> \ left /> _ >>>>> ^ \ \ mathrm >>>> \ right. > \) .Testele TaqMan și grundurile SYBR Green sunt listate în Tabelul 2 al ESM.

ELISA

Nivelul de SEMA3C secretat din scWAT intact (300 mg bucăți în mediu de 3 ml) a fost evaluat și incubat așa cum este descris [25]. Mediul a fost salvat la -70 ° C pentru determinarea nivelurilor SEMA3C conform instrucțiunilor producătorului (E80919Hu; USCN Life Science, Wuhan, Republica Populară Chineză). Curba standard a kitului SEMA3C ELISA a variat între 78 și 5.000 pg/ml, iar cel mai mic nivel detectabil a fost de 27,7 pg/ml, conform manualului de instrucțiuni furnizat de producător. Specificitatea kitului ELISA a fost confirmată prin western blot folosind doi anticorpi diferiți (vezi ESM Fig. 1 și ESM Methods; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA și R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA, respectiv). Secreția de proteină SEMA3C din explantele WAT ale participanților obezi și ne-obezi a fost legată de numărul de celule adipoase din proba de țesut incubat. Factorul de creștere a țesutului conjunctiv (CTGF, E90010Hu; USCN Life Science), ELN (E91337Hu; USCN Life Science), IL6 (D6050; Sisteme de cercetare și dezvoltare) și transformarea factorului de creștere-β1 (TGF-β1) (DB100B; Sisteme de cercetare și dezvoltare) secreția de proteine ​​a fost măsurată în medii de cultură condiționate din adipocite diferențiate in vitro conform instrucțiunilor producătorului.

Imunofluorescență și microscopie confocală

Analiza imunofluorescenței rețelelor de colagen/fibronectină produse de pre-adipocite umane a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [26] și așa cum este detaliat în metodele ESM.

Analize imunohistochimice

Probele WAT subcutanate au fost preparate pentru analize imunohistochimice așa cum este descris în Metodele ESM și în alte părți [27, 28]. Microfotografiile reprezentative sunt prezentate în figurile 2, 3 ale ESM.

Experimente de hipoxie

Mediile condiționate din adipocite mature au fost obținute după 24 de ore de cultură în mediu bazal de celule endoteliale (1/3, vol./vol.) Suplimentat cu 0,1% BSA, 100 U/ml penicilină și 100 g/ml streptomicină în casete de cultură CLINIcell (Mabio, Tourcoing, Franța) în camere de normoxie (21% O2) sau de hipoxie (1% O2; Sanyo, Avon, Franța).

Experimente de stimulare SEMA3C

Culturile pre-adipocite și adipocite au fost stimulate, în primele 6 sau ultimele 2 zile de diferențiere, respectiv, cu 1-500 ng/ml proteină recombinantă umană SEMA3C-Fc-fuziune (5570-S3-050; Sisteme de cercetare și dezvoltare). Pentru pre-adipocite, mediul care conține SEMA3C recombinant a fost schimbat în a treia zi de incubație. După stimulare, mediul de cultură condiționat a fost colectat și celulele au fost lizate pentru ARN total sau efectele asupra transportului glucozei [29] și lipoliza [30] au fost evaluate exact așa cum s-a descris. Experimentele au fost efectuate în duplicat sau triplicat cu celule netratate ca martor. Incubațiile cu o proteină Fc: control de fuziune (ALX-203-004-C050; Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, SUA) au fost utilizate ca un control negativ pentru a exclude posibilele efecte mediate de Fc asupra expresiei genice. Nu s-au observat modificări ale nivelurilor de ARNm pentru genele reglementate de SEMA3C (ESM Fig. 4).

analize statistice

Datele prezentate în cifre sunt medii ± SEM. Pentru tabele, rezultatele sunt prezentate ca medie ± SD, interval și/sau modificare a pliurilor după cum este detaliat. Pentru seturile de date care nu au fost distribuite în mod normal, au fost utilizate valorile transformate log10. Rezultatele au fost analizate cu teste statistice parametrice/non-parametrice adecvate, inclusiv perechea/nepereche a lui Student t test, test de semnare Wilcoxon, analiză de regresie simplă/multiplă și analiză a varianței folosind pachete software standard.

Rezultate

Identificarea de noi adipokine candidate reglementate de modificări ale greutății

Cartarea expresiei de semaforină de clasa 3 în țesutul adipos uman

Din moment ce se știe puțin despre familia SEMA de clasa 3 în WAT uman, am cartografiat expresia SEMA3 în cohortele 1-3. Deși au fost detectate semnale pentru toți cei șapte liganzi și doi dintre membrii familiei au fost reglementați fie de obezitate (SEMA3G) sau pierderea masei grase (SEMA3B), numai SEMA3C a fost reglementată în toate cele trei cohorte (Tabelul 4 al MES). Rezultatele obezității și pierderii în greutate au fost confirmate prin RT-PCR cantitativă, demonstrând că scWAT SEMA3C Nivelurile de ARNm au crescut în obezitate și în sindromul metabolic (cohorta 6, Fig. 1a) și au fost reduse la scăderea voluntară în greutate (prin intervenție chirurgicală bariatrică, cohorta 7, Fig. 1b) și scăderea involuntară în greutate (cașexie, cohorta 3, Fig. 1c ).

adipokină

SEMA3C este o nouă adipokină exprimată predominant în celulele adipoase

Nivelurile de țesut adipos SEMA3C sunt asociate cu rezistența la insulină și morfologia celulelor adipoase

În timp ce rezultatele obținute până acum demonstrează că SEMA3C este o adipokină care este reglementată de modificările de greutate, acestea nu oferă nicio informație cu privire la rolul SEMA3C în funcția WAT. Am evaluat dacă SEMA3C Nivelurile de ARNm au fost asociate cu orice variabilă clinică din cohorta 1. SEMA3C corelat pozitiv cu nivelurile de glucoză și insulină circulante, măsurători ale rezistenței la insulină pe tot corpul (HOMA de insulină rezistență [HOMAIR] [33] și rata constantă pentru testul de toleranță la insulină [KITT]) și dimensiunea și morfologia celulelor adipoase independent de IMC (Tabelul 1). În plus, nivelurile de SEMA3C secretate de la explantele WAT s-au corelat semnificativ cu HOMAIR independent de IMC (Fig. 2c). Aceste descoperiri ne-au încurajat să evaluăm funcția SEMA3C in vitro.

Caracterizarea funcțională a SEMA3C în adipocite umane primare

Efectul proteinei SEMA3C recombinante asupra culturilor primare de adipocite umane a fost determinat folosind concentrații în intervalul de 10-500 ng/ml. Aceste concentrații au fost alese pe baza intervalelor utilizate în studiile publicate pe celule non-adipoase [34]. Adipocitele au fost incubate cu SEMA3C timp de 48 de ore și s-a determinat efectul asupra transportului glucozei, lipolizei și expresia genelor care reglementează oxidarea lipidelor. Cu toate acestea, nu s-a observat niciun efect semnificativ asupra oricăreia dintre aceste variabile (ESM Fig. 5). Lipsa răspunsului ne-a determinat să stabilim dacă receptorii SEMA3C sunt exprimați în adipocite umane diferențiate. Așa cum este detaliat în Fig. 3a, expresia tuturor receptorilor, cu excepția PLXNA2 (care s-a găsit la niveluri foarte scăzute), a fost marcat în jos în timpul diferențierii adipocitelor, sugerând că SEMA3C poate acționa asupra celulelor progenitoare adipocite (pre-adipocite) prezente în WAT.

SEMA3C reglementează producția de componente legate de ECM în pre-adipocite umane primare

Discuţie

Există relativ puține studii publicate despre SEMA3C în general (-/- șoareci, care mor la scurt timp după naștere din cauza malformațiilor cardiovasculare congenitale [46]. Am incubat celule endoteliale derivate din adipoză umană (CD34 +/CD31 +) cu SEMA3C in vitro, dar nu am putut observa efecte proliferative (nereprezentate) Cu toate acestea, acest lucru nu exclude posibilitatea ca SEMA3C să aibă un impact asupra altor aspecte ale funcției angiogenezei/celulelor endoteliale în WAT uman.

O avertizare în studiul nostru este că majoritatea participanților au fost femei. Cu toate acestea, la bărbații înscriși, nu a existat nicio indicație că sexul ar fi influențat expresia SEMA3C. Luate împreună, datele noastre sugerează că SEMA3C este o adipokină nouă, a cărei expresie se corelează semnificativ cu schimbarea în greutate, hipertrofia celulelor adipoase, fibroza adipoasă și rezistența la insulină la om. În timp ce SEMA3C recombinant nu afectează direct sensibilitatea la insulină în adipocite, stimulează producerea și eliberarea proteinelor structurale și matricelulare în pre-adipocite. Ipotezăm că SEMA3C poate fi un factor care permite remodelarea WAT, ale cărei tulburări pot contribui la dezvoltarea rezistenței la insulină și a diabetului de tip 2.