Abstract

Introducere

Hipotalamusul mediobasal (MBH) este o regiune cheie a creierului care evaluează disponibilitatea energiei prin detectarea hormonilor și nutrienților pentru a coordona homeostazia energetică. În cadrul MBH, proteinele asociate agouti (AgRP) și neuronii pro-opiomelanocortină (POMC) joacă roluri critice în comportamentul ingestiv. Activarea neuronilor AgRP crește rapid și semnificativ aportul de alimente (1-3), în timp ce ablația neuronilor AgRP la șoarecii adulți are ca rezultat înfometarea profundă și pierderea în greutate (4-6). Activarea neuronilor POMC reduce pofta de mâncare (7,8), în timp ce inhibarea neuronilor POMC crește modest hrănirea (8).

receptorilor

Receptorul de insulină (IR) este exprimat atât în ​​neuroni AgRP, cât și în neuroni POMC. Deși sa demonstrat că insulina hiperpolarizează și inhibă neuronii AgRP și POMC (9-11), există rapoarte că insulina poate activa și neuronii AgRP și POMC (11,12), posibil ca urmare a eterogenității dintre acești neuroni. Ștergerea IR de la neuronii AgRP (AgRP IR KO) are ca rezultat o rezistență ușoară la insulină hepatică (9), definită ca capacitatea redusă a insulinei de a suprima producția hepatică de glucoză (hGP). Cu toate acestea, în ciuda rezistenței la insulină hepatică, rata de perfuzie a glucozei (GIR) necesară pentru menținerea euglicemiei în timpul clemelor hiperinsulinemice nu a fost modificată la șoarecii AgRP IR KO și, mai important, au fost, de asemenea, capabili să mențină toleranța normală la glucoză (9), indicând faptul că afectarea acțiunii insulinei hepatice a fost moderată. În schimb, ștergerea IR în neuronii POMC (șoareci POMC IR KO) nu a modificat hGP sau a afectat toleranța la glucoză atunci când șoarecii au fost hrăniți cu o dietă standard de chow (9,13).

Semnalizarea insulinei cerebrale controlează metabolismul țesutului adipos alb (WAT) prin suprimarea lipolizei și stimularea unei noi lipogeneze, permițând WAT să stocheze lipidele (14,15). Capacitatea WAT ​​de a trece rapid de la o stare lipolitică în timpul postului (care oferă acizi grași liberi și glicerol pentru a fi folosiți ca substraturi energetice în organe precum mușchiul și ficatul) la un mod de stocare a lipidelor după ingestia mesei (care este important pentru a preveni lipotoxicitatea ) este esențială pentru sănătatea metabolică și este redusă în sindromul metabolic și diabetul de tip 2 (16). Hrana cu diete bogate în grăsimi (HFD) afectează rapid acțiunea insulinei cerebrale, ducând la suprimarea afectată a lipolizei hGP și a țesutului adipos și poate duce la steatoză hepatică (17-20). Având în vedere importanța funcționalității WAT pentru sănătatea metabolică, este necesară o mai bună înțelegere a căilor neuronale care mediază acțiunea insulinei cerebrale pentru a controla lipoliza WAT.

Activarea semnalizării melanocortinergice induce lipoliza WAT ​​printr-un flux simpatic crescut (21), indicând faptul că neuronii POMC participă la reglarea simpatică a țesutului adipos. Rolul neuronilor AgRP în reglarea metabolismului țesutului adipos este mai puțin bine definit. Scopul studiului nostru a fost de a examina rolul semnalizării insulinei în neuronii AgRP și POMC în reglarea acțiunii insulinei hepatice și a lipolizei țesutului adipos.

Proiectare și metode de cercetare

Animale

Cleme hiperinsulinemice-euglicemice

La 5 zile după implantarea unui cateter de venă jugulară (15), șoarecii au fost studiați prin cleme hiperinsulinemico-euglicemice. Mâncarea a fost îndepărtată la 9 a.m., iar animalele au fost conectate la catetere la 11 a.m. când au început perfuziile. Pentru a determina fluxurile de glucoză și glicerol, perfuzii continue amorsate de [U- 13 C-6] - d-glucoză (0,6 μmol * kg −1 * min −1) și [2 H-5] -glicerol (4 μmol * kg ) −1 * min −1) au fost începute la t = -100 min, moment în care a fost colectată plasma inițială, iar perfuziile trasoare au fost continuate până la t = 120 min. Insulina umană (Novolin; Novo Nordisk, Princeton, NJ) a fost amorsată (72 mU * kg -1 * min -1) la t = 0 min timp de 1 min și apoi perfuzată continuu la 4 mU * kg -1 * min -1 pentru 2 ore. Glicemia a fost monitorizată la fiecare 10 minute și 25% dextroză a fost perfuzată cu o rată variabilă pentru a menține euglicemia. Sângele (60 μL) a fost colectat în tuburi EDTA de mai multe ori prin tăieturi de coadă și procesat pentru măsurarea insulinei plasmatice și a lipidelor. Animalele au fost anesteziate cu izofluran și sacrificate la capătul clemelor (22). Țesuturile și ficatul adipos perigonadal au fost recoltate, congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C până la o analiză ulterioară

Fluxuri de glucoză și glicerol

Fluxurile au fost determinate așa cum s-a descris anterior (23). Glicerolul sau glucoza Ra (μmol * kg −1 * min −1) a fost calculat prin ecuația Ra = (MPEinf/MPEpl - 1) × R, unde MPEinf este îmbogățirea izotopă fracționată a D5-glicerolului infuzat sau [13 C6] glucoză în exces procentual de masă (MPE), MPEpl este îmbogățirea probei de plasmă (15) și R este rata de perfuzie a izotopului în μmol * kg −1 * min −1 .

Calorimetrie indirectă

Pentru a evalua consumul de energie și raportul de schimb respirator (RER), șoarecii au fost plasați în cuști metabolice pentru calorimetrie indirectă (TSE Systems, Inc., Chesterfield, MO) timp de 5 zile. Animalele au fost hrănite cu diete și apă ad libitum și s-au aclimatizat timp de 3 zile. Șoarecii au fost găzduiți singuri în cuști etanșe la gaze cu un debit de 0,40 L/min. Schimbul de gaz O2 și CO2 a fost măsurat la o rată de eșantionare de 40 s pe cușcă. Activitatea fizică a fost determinată concomitent folosind un sistem cu fascicul de lumină infraroșu unidimensional instalat pe fundul cuștilor.

Test de toleranță la glucoză

După un post de 5 ore, animalele hrănite cu HFD au fost injectate intraperitoneal cu soluție de glucoză 15% (0,8 g/kg corp greutate). Glicemia a fost determinată în probe de vene de coadă folosind un glucometru manual (OneTouch Ultra; LifeScan, Milpitas, CA) la t = 0, 15, 30, 60, 90 și 120 min.

Test de toleranță la rece

După ce temperatura rectală a fost măsurată la temperatura camerei ambiante cu o mică sondă de termometru rectal (BAT MO-15; Physitemp, Clifton, NJ), animalele cu o singură locuință au fost mutate într-o cameră rece la 4 ° C, iar temperatura rectală a fost măsurată la fiecare 30 min timp de 2 ore.

Extracția trigliceridelor hepatice

Extracția de trigliceride folch (TG) a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (24-26). Pe scurt, țesuturile hepatice (100 mg) au fost omogenizate în 3 ml dintr-un amestec de metanol și cloroform (raport 1: 2). După incubare timp de 4 ore, s-au adăugat 1,5 mL de 0,1 mol/L NaCl la omogenate și probele au fost agitate. După centrifugare la 1.000 rpm timp de 10 minute la temperatura camerei, faza organică inferioară conținând TG-uri a fost transferată într-un tub nou, urmată de evaporarea solventului organic cu azot gazos. În cele din urmă, 200 μL de 3 mol/L KOH în 65% etanol au fost adăugați la TG-urile extrase și probele au fost incubate la 70 ° C timp de 1 oră.

Extracția ARN și PCR cantitativă în timp real

ARN-ul total din ficat a fost extras și procesat așa cum s-a descris anterior (23). Datele au fost analizate cu metoda comparativă Ct (27). Secvențele de primeri PCR cantitativi în timp real au fost după cum urmează: IL-6, 5'-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3 '(înainte) și 5'-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-3' (invers); 18S, 5′-GGGACTTAATCAACGCAAGC-3 ′ (înainte) și 5′-GTGGAGCGATTTGTCTGGTT (invers).

Insulina ELISA

Nivelurile de insulină plasmatică au fost determinate cu Mercodia Insulin ELISA conform protocolului producătorului. Datele au fost analizate prin efectuarea regresiei splinei cubice cu Prism (Software GraphPad).

Alte măsurători biochimice

Glicemia în timpul clemelor a fost măsurată cu ajutorul glucometrului manual, după cum s-a indicat mai sus. Glicerina liberă de plasmă și TG-urile au fost măsurate cu un test colorimetric (Trigliceride Kit; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), iar acidul gras neesterificat plasmatic (NEFA) a fost măsurat cu un test colorimetric (HR Series NEFA; Wako Chemicals, Richmond, VA).

Statistici

Mecanismul propus. Semnalizarea insulinei în neuronii AgRP suprimă hGP, dar nu modifică lipoliza țesutului adipos. Pe de altă parte, semnalizarea insulinei în neuronii POMC nu reglează hGP, dar limitează lipoliza țesutului adipos. Hrănirea cronică a HFD la șoareci cu ștergerea IR în neuronii POMC exacerbează lipoliza și crește fluxul de acizi grași liberi (FFA) în ficat, crescând susceptibilitatea la steatoza hepatică indusă de HFD. 3V, al treilea ventricul.

Deși Könner și colab. (9) au raportat, de asemenea, că șoarecii AgRP IR KO prezintă mRNA IL-6 hepatic redus, nu am găsit nicio diferență. Motivele pentru aceste rezultate diferite ale expresiei hepatice IL-6 la șoareci AgRP IR KO pot fi explicate prin perioada de post semnificativ mai lungă înainte de clema hiperinsulinemică în Könner și colab. studiu comparativ cu cel din studiul nostru (16 ore vs. 6 ore), deoarece o perioadă mai lungă de post a crescut probabil expresia genei gluconeogene la un nivel mai înalt. Prin urmare, capacitatea insulinei de a suprima hGP poate apărea, de asemenea, independent de semnalizarea hepatică STAT-3/IL-6.

S-a demonstrat că insulina stimulează (12) sau inhibă (9,10) neuronii POMC. Constatarea noastră că șoarecii lipsiți de IR în neuronii POMC prezintă acțiune afectată de insulină a țesutului adipos, rezultând lipoliză nestăvilită, împreună cu descoperirile lui Brito și colab. (21) că semnalizarea melanocortinergică stimulează lipoliza WAT, susține ideea că insulina inhibă în cea mai mare parte neuronii POMC. Este interesant de observat că, în modelul nostru experimental, lipoliza țesutului adipos nu pare a fi critică în inducerea rezistenței la insulină hepatică, după cum sa raportat recent de grupul Shulman (35), deoarece capacitatea insulinei de a suprima hGP este normală în POMC IR Șoareci KO, chiar dacă suprimarea lipolizei este afectată.

O altă explicație plauzibilă pentru lipsa rezistenței la insulină hepatică la șoarecii POMC IR KO, în ciuda lipolizei lor neîngrădite, ar putea fi faptul că glicerolul circulant și acizii grași liberi sunt ușor utilizați de alte organe decât ficatul, menținând astfel nivelurile plasmatice normale, în ciuda lipolizei crescute. Într-adevăr, acești șoareci prezintă profiluri lipidice plasmatice nealterate și, mai important, RER mai mic, ceea ce este în concordanță cu oxidarea preferențială a lipidelor. Prin urmare, șoarecii POMC IR KO par să fi dezvoltat un mecanism compensator pentru a menține nivelurile normale de lipide circulante în ciuda mobilizării crescute a acidului gras din țesutul adipos, iar acest lucru poate explica acțiunea normală a insulinei hepatice și toleranța la glucoză la acești șoareci (9). Hill și colab. (13) au arătat că nici ștergerea singură a receptorului de leptină și nici ștergerea combinată a insulinei și a receptorului de leptină în neuronii POMC nu modifică RER. Acest lucru ar sugera că IR necesită semnalizarea intactă a receptorilor de leptină în neuronii POMC pentru a duce la modificarea RER.

Persoanele obeze prezintă adesea rate lipolitice crescute în comparație cu persoanele slabe (36), iar fluxul lipolitic crescut din țesutul adipos în ficat poate provoca steatoză hepatică și rezistență sistemică la insulină (37,38). Hrănirea cu HFD pare să crească activitatea neuronală AgRP (39-41), dar nu pare să înrăutățească fenotipul metabolic al șoarecilor AgRP IR KO, posibil pentru că neuronii lor AgRP sunt deja dezinhibați de lipsa semnalizării insulinei. Deși insulina pare să reducă și rata de ardere a neuronilor POMC, hrănirea cu HFD crește activitatea neuronală a POMC și/sau tonusul melanocortinergic (42-45), iar lipsa semnalizării insulinei în neuronii POMC potențează efectele dismetabolice ale hrănirii cu HFD. Pe de o parte, rezistența la insulină în neuronii POMC în timpul hrănirii cu HFD are ca rezultat probabil supraactivarea POMC, care este un factor important al lipolizei neîngrădite care duce la steatoză hepatică. Pe de altă parte, am găsit niveluri plasmatice mai ridicate de NEFA la șoareci AgRP IR KO în timpul hrănirii cu HFD, în ciuda niciunei dovezi de steatoză hepatică. Nivelurile crescute de NEFA pot fi cauzate de utilizarea redusă a lipidelor și/sau creșterea lipolizei țesutului adipos.

Reglarea lipolitică afectată în POMC IR KO a fost identificată prin utilizarea tehnicii de diluare a glicerolului în timpul clemelor de insulină. Lipoliza neîngrădită poate provoca ficat gras pe care șoarecii POMC IR KO îl dezvoltă în timpul hrănirii cu HFD. Deși evaluarea lipazei hormonale sensibile și/sau a fosforilării perilipinei sau a nivelului de adipozitate este uneori utilizată pentru a evalua lipoliza în țesutul adipos, aceste metode au mai multe limitări, în special după alimentarea cronică cu HFD. În primul rând, deși lipaza sensibilă la hormoni și fosforilarea perilipinei sunt buni markeri ai lipolizei după un stimul lipolitic acut, stările lor de fosforilare sunt în mod obișnuit suprimate după alimentarea cu HFD (46-49). Acest lucru poate apărea la prima vedere paradoxal, deoarece lipoliza este de obicei crescută după hrănirea cu HFD, dar probabil poate fi atribuită desensibilizării adrenergice cauzată de supraestimularea cronică. În mod similar, masa de grăsime este în mod obișnuit crescută în obezitate, în timp ce lipoliza este neîngrădită și, prin urmare, nivelul de adipozitate nu este un bun indicator al reglării lipolitice. Prin urmare, aceste dezavantaje justifică utilizarea Ra a glicerolului, deoarece această metodă evită aceste avertismente.

În concluzie, demonstrăm că semnalizarea insulinei în neuronii POMC joacă un rol critic în acțiunea insulinei țesutului adipos prin restrângerea lipolizei, dar pare dispensabilă pentru capacitatea insulinei de a suprima hGP. În schimb, semnalizarea insulinei în neuronii AgRP reglează hGP fără a afecta lipoliza țesutului adipos. Rezistența la insulină în neuronii POMC poate juca un rol important în dezvoltarea steatozei hepatice după hrănirea cu HFD. Prin urmare, studiul nostru demonstrează că semnalizarea insulinei în neuronii POMC joacă un rol critic în reglarea funcției țesutului adipos și, la rândul său, în sensibilitatea la dezvoltarea ficatului gras.

Informații despre articol

Mulțumiri. Autorii îi mulțumesc lui Wilson Hsieh, de la Școala de Medicină Icahn din Muntele Sinai, pentru asistență tehnică.

Finanțarea. Acest studiu a fost finanțat de Institutul Național pentru Diabet și Boli Digestive și Rinice acordă granturi K01-DK-099463 (ACS) și R01-DK-082724, Institutul Național pentru Abuzul de Alcool și Alcoolismul acordă R01-AA-023416 și American Diabetes Grant de asociere 7-11-CD-02 (CB).

Dualitatea interesului. Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.