De la Medicina Interna I, National Defense Medical College (K.I., Y.K., M.A., M.K., F.O.), Tokorozawa, Japonia, și Divizia de resurse de cercetare biomedicală, Juntendo University School of Medicine (N.T.), Tokyo, Japonia.

De la Medicina Interna I, National Defense Medical College (K.I., Y.K., M.A., M.K., F.O.), Tokorozawa, Japonia, și Divizia de resurse de cercetare biomedicală, Juntendo University School of Medicine (N.T.), Tokyo, Japonia.

De la Medicina Internă I, Colegiul Național de Apărare Medicală (K.I., Y.K., M.A., M.K., F.O.), Tokorozawa, Japonia și Divizia de Resurse de Cercetare Biomedică, Școala de Medicină a Universității Juntendo (N.T.), Tokyo, Japonia.

De la Medicina Internă I, Colegiul Național de Apărare Medicală (K.I., Y.K., M.A., M.K., F.O.), Tokorozawa, Japonia și Divizia de Resurse de Cercetare Biomedică, Școala de Medicină a Universității Juntendo (N.T.), Tokyo, Japonia.

De la Medicina Interna I, National Defense Medical College (K.I., Y.K., M.A., M.K., F.O.), Tokorozawa, Japonia, și Divizia de resurse de cercetare biomedicală, Juntendo University School of Medicine (N.T.), Tokyo, Japonia.

De la Medicina Interna I, National Defense Medical College (K.I., Y.K., M.A., M.K., F.O.), Tokorozawa, Japonia, și Divizia de resurse de cercetare biomedicală, Juntendo University School of Medicine (N.T.), Tokyo, Japonia.

Vizualizați cea mai recentă versiune a acestui articol. Versiunile anterioare:

Abstract

Fundal- Osteopontina (OPN) este o proteină de aderență necolagenă găsită la locul leziunilor aterosclerotice. Cu toate acestea, nu s-a clarificat încă dacă OPN poate promova sau nu leziunile aterosclerotice.

Metode și rezultate— Am investigat contribuția OPN la ateroscleroză prin evaluarea leziunilor sinusurilor aortice atât ale șoarecilor transgenici (Tg) OPN, cât și ai șoarecilor non-Tg hrăniți cu o dietă aterogenă (1,25% colesterol) timp de 16 săptămâni. S-a constatat că leziunile aterosclerotice sunt semnificativ mai mari în OPN-Tg comparativ cu cele din non-Tg (17 859 ± 2010 versus 6469 ± 485 μm 2, P 1-4 Am raportat recent că șoarecii transgenici (Tg) OPN au arătat o creștere a grosimii mediale a arterei fără vătămare și o creștere a formării neointimale după vătămare. 5 Luate împreună, aceste rezultate sugerează că OPN poate juca un rol important în etapa inițială a aterosclerozei, inclusiv proliferarea și migrarea celulelor musculare netede. Cu toate acestea, rămâne de clarificat dacă OPN poate sau nu să promoveze leziunile aterosclerotice. Scopul prezentului studiu a fost de a determina dacă OPN are un efect de promovare sau inhibitor asupra aterosclerozei la șoarecii OPN-Tg.

Metode

Animale și dietă

Șoarecii OPN-Tg 5 caracterizați anterior crescuți în laboratorul nostru au fost folosiți în conformitate cu protocoale aprobate de Consiliul Colegiului Medical pentru Apărare Națională pentru Studii pe Animale Experimentale. În studiul de față, am comparat OPN-Tg heterozigot cu colegii de litiere non-Tg (non-Tg). Începând cu 8 săptămâni după naștere și continuând timp de 16 săptămâni, atât șoarecii OPN-Tg, cât și cei non-Tg au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi/colesterol, conținând 15% grăsimi, 1,25% colesterol și 0,5% colat de sodiu, denumit în continuare dieta aterogenă. Acești șoareci au fost uciși la vârsta de 24 de săptămâni pentru a fi supuși unei analize lipoproteice plasmatice și a unei analize a leziunilor.

Măsurători lipidice plasmatice

În ziua analizei, mâncarea a fost îndepărtată din cuști dimineața, iar șoarecii au fost posti timp de 7 ore. Colesterolul total plasmatic, colesterolul cu lipoproteine ​​cu densitate mare (HDL) și nivelurile de trigliceride au fost apoi măsurate prin teste enzimatice, așa cum s-a descris anterior. 6

Cuantificarea leziunilor sinusale aortice

Secțiunile care conțin sinus aortic au fost pregătite așa cum sa raportat anterior, 7 cu modificări. Aria leziunii a fost măsurată cu National Institutes of Health Image 1.55 (software de domeniu public). Valorile raportate au reprezentat aria leziunii medii din 5 secțiuni pentru fiecare animal. Gradul de ateroscleroză în aorta șoarecelui a fost, de asemenea, determinat printr-o metodă „en face”. 8

Studii imunohistochimice

Secțiunile înghețate au fost incubate fie cu un anticorp monoclonal primar de șobolan împotriva macrofagelor de șoarece, clonă MOMA-2 (BioSource International), fie cu un anticorp policlonal primar de capră împotriva Interleukinei de șoarece (IL) -10 (Pharmingen). Imunomarcarea a fost vizualizată așa cum s-a descris anterior. 5

Analiza abilității producției de IL-10 de către macrofage

Macrofagele peritoneale rezidente de la șoareci non-Tg și șoareci OPN-Tg obținuți prin spălare peritoneală cu soluție salină tamponată cu fosfat au fost tratați cu tampon de liză de celule roșii și au fost incubați (105 macrofage la 100 μL) timp de 2 ore. Fracția aderentă a fost incubată cu lipopolizaharidă (LPS) (30 ng/ml) timp de 48 de ore. Supernatantul IL-10 a fost testat cu kituri ELISA comerciale (sisteme R&D).

Analize statistice

figura 1. Fotomicrografii ușoare reprezentative ale leziunilor aterosclerotice aortice atât din non-Tg (stânga), cât și din OPN-Tg (dreapta). Secțiunile au fost colorate cu roșu ulei O și hematoxilină (panourile superioare și medii). Zonele în cutie sunt afișate în mijlocul panourilor. Săgeata arată că lipidele au fost conținute în stratul medial. Panourile inferioare prezintă colorarea MOMA-2 a ambilor șoareci. Mărire originală × 25 (panouri superioare), × 50 (panouri inferioare) și × 100 (panouri inferioare).

Modularea OPN a producției de macrofage IL-10

Studiile recente la șoareci au arătat că deficiența șoarecilor în expresia genei OPN a demonstrat o creștere a producției de IL-10, 9 și a arătat că supraexprimarea IL-10 ar putea inhiba formarea de dungi grase în cazul în care șoarecii au fost hrăniți cu o dietă aterogenă. 10,11 Pe baza rezultatelor acestor rapoarte, am efectuat analize imunohistochimice. Așa cum se arată în Figura 2A, șoarecii non-Tg au exprimat niveluri detectabile de IL-10 comparativ cu șoarecii OPN-Tg. Pentru a clarifica contribuția IL-10, am examinat în continuare producția de IL-10 la șoareci. Figura 2B prezintă producția de IL-10 de către macrofage peritoneale de la șoareci ONP-Tg și non-Tg. Figura 2B (stânga) arată producția de IL-10 fără stimulare, în care ambele grupuri de macrofage peritoneale au eliberat puțin IL-10. Cu toate acestea, nivelurile IL-10 au fost mai mici la șoarecii OPN-Tg decât la șoarecii non-Tg (19,8 ± 1,7 față de 34,0 ± 2,9 pg/ml, P

transgenici

Figura 2. A, fotomicrografii reprezentative care arată colorarea imunohistochimică pentru IL-10 în leziunile aterosclerotice de non-Tg (stânga) și OPN-Tg (dreapta). Expresia IL-10 a fost detectată în leziunea non-Tg (colorare maro). Mărire originală × 150. B, producerea de IL-10 de către macrofage peritoneale de la șoareci non-Tg și OPN-Tg. Panoul din stânga arată producția de IL-10 fără LPS, iar panoul din dreapta arată producția de IL-10 prin macrofage stimulate cu LPS. Valorile reprezintă media ± SE. *P

Discuţie

Am raportat recent că nu a existat nicio formare neointimală la șoarecii noștri OPN-Tg hrăniți cu chow normal, deși șoarecii OPN-Tg au prezentat o îngroșare mediană crescută în funcție de îmbătrânire. Cu toate acestea, în răspunsul la leziuni arteriale, s-au format mai multe neointima la OPN-Tg decât la șoareci non-Tg. 5 Aceste rezultate sugerează că migrația SMC și formarea neointima de către OPN sunt induse atunci când intima este afectată. S-a raportat că disfuncția endotelială este indusă de hipercolesterolemie. 12 Ca rezultat, credem că hipercolesterolemia a indus mai multe leziuni aterosclerotice în OPN-Tg decât în ​​non-Tg.

Deși nivelurile HDL au scăzut în OPN-Tg, nu s-a observat nicio diferență semnificativă între OPN-Tg și non-Tg, iar nivelurile totale de colesterol au avut tendința de a scădea în non-Tg. Astfel, credem că nivelurile de HDL au contribuit ușor la creșterea leziunilor cu striuri grase în OPN-Tg. Prezentul studiu arată că formarea timpurie a dungilor grase a fost promovată de OPN, dar constatările nu au arătat dacă OPN are sau nu vreun efect asupra leziunilor mai mature și avansate. Astfel, credem că supraexpresia OPN trebuie să fie creată pe fundalul deficit de apoE pentru a determina dacă OPN are sau nu vreun efect asupra leziunilor avansate. Cu toate acestea, rămâne important să se determine dacă OPN poate fi modulat prin tratament și dacă o astfel de abordare poate fi sau nu utilizată pentru a modula răspunsurile imune și a reduce ateroscleroza.

Aceste studii au fost susținute parțial de subvențiile Organizației pentru Energie Nouă și Dezvoltare a Tehnologiei Industriale.