Olga Yakovleva

Ksenia Bogatova

Renata Mukhtarova

Aleksey Yakovlev

Viktoria Șahmatova

Elena Gerasimova

Guzel Ziyatdinova

2 Departamentul de chimie analitică, Universitatea Federală din Kazan, str. Kremlevskaya 18, 420008 Kazan, Rusia; ur.liam@gavonidtayiz

Anton Hermann

3 Departamentul de Biosciences, Universitatea din Salzburg, Salzburg 5020, Austria; [email protected]

Guzel Sitdikova

Date asociate

Abstract

1. Introducere

Sulfura de hidrogen (H2S), stabilită ca al treilea gazotransmițător împreună cu oxidul azotic și monoxidul de carbon, este produsă endogen în diferite țesuturi și mediază numeroase procese fiziologice și fiziopatologice [1,2]. În sistemul nervos central H2S facilitează inducerea potențării pe termen lung [3], îmbunătățește memoria fricii la șobolanii în vârstă [4], modulează excitabilitatea neuronală [5,6], crește nivelurile intracelulare de Ca 2+, generează unde Ca 2+ în astrocite [7] și este implicat în generarea și conducerea durerii somatice și viscerale [8,9]. Studii recente indică un rol neuroprotector al H2S în diferite patologii neurologice [10,11], inclusiv Alzheimer și [12] boala Parkinson [13], epilepsie [14] sau leziuni cerebrale după accident vascular cerebral ischemic [15] datorită caracteristicilor antioxidante ale H2S [2.16].

Mai mulți autori au raportat că există patru căi enzimatice implicate în producția de H2S: cistationina β-sintază (CBS), cistationina γ-lyase (CSE) și 3-mercaptopiruvat sulfurtransferază (3MCT) cuplată cu cisteina amino transferază (CAT) și 3MCT cuplat cu D-aminoacid oxidază (DAO) [2,11,17,18,19]. CBS și CSE sunt enzime dependente de piridoxal 5'-fosfat (PLP) localizate în citosol, în timp ce 3-MST independent de PLP generează în principal H2S în mitocondrii. Expresia enzimelor producătoare de H2S este specifică țesutului. CBS și 3-MST se găsesc predominant în sistemul nervos central, deși aceste enzime sunt prezente și în țesuturile periferice, unde CSE apare abundent în ficat și în mușchii netezi vasculari și non-vascular [2,11,17,18,19].

Nivelurile crescute de homocisteină afectează concentrația H2S și expresia/activitatea enzimelor generatoare de H2S în modele in vitro și in vivo [11,20]. Injecția intracerebroventriculară de homocisteină a scăzut expresia CBS și CSE în hipocampul șobolanului și a condus la disfuncții de învățare și de memorie [35,36]. În studiul nostru anterior, administrarea donatorului de H2S la șobolani femele cu hHcy în timpul sarcinii a restabilit afectarea dezvoltării descendenților în primele 3 săptămâni după naștere [28]. Scopul prezentului studiu este de a evalua efectele donatorului de H2S asupra anxietății, comportamentului motor și cognitiv, nivelul de stres oxidativ din țesuturile cerebrale, concentrația de H2S și activitatea/expresia CBS la șobolanii adulți cu hHcy matern.

2. Materiale și metode

2.1. Animale

Experimentele au fost efectuate folosind șobolani Wistar în conformitate cu Directiva UE 2010/63/UE pentru experimente pe animale și Comitetul Etic Local Universitatea Federală din Kazan (protocolul nr. 8 din 5 mai 2015). Animalele au fost adăpostite în cuști din polipropilenă (32 × 40 × 18 cm) la temperatură controlată (22-24 ° C), cu un program de lumină 12:12 L/D (luminile aprinse la 6:00 am) și acces gratuit la alimente și apă.

Șobolanii gravide au fost împărțiți în patru grupe după cum urmează: un grup a fost hrănit ad libitum cu o dietă de control (n = 7), al doilea grup (n = 11) a primit metionină zilnic (7,7 g/kg greutate corporală) cu alimente începând cu 3 săptămâni înainte și în timpul sarcinii și alăptării până la înțărcare la P21 [29,37]. Al treilea grup (n = 4) a primit donatorul de H2S, hidrosulfură de sodiu (NaHS) cu trei săptămâni înainte și pe tot parcursul sarcinii conform următorului protocol: 7 zile de injecții alternate cu 7 zile de adaptare [28]. Șobolanii din grupa a patra (n = 4) au primit zilnic metionină și injecții de NaHS conform protocoalelor menționate mai sus (Figura 1 a). NaHS a fost diluat în soluție salină sterilizată și injectat subcutanat (i.s.c.) la o doză de 3 mg/kg.

sulfura

Testarea comportamentală, analiza stresului oxidativ și nivelul H2S, activitatea și expresia CBS în țesuturile cerebrale au fost efectuate la vârsta de P72-90, cu excepția testului labirintului Morris Water care a fost efectuat la P21-22 (Figura 1 a). Deoarece nu au fost înregistrate diferențe semnificative între șobolani masculi și femele, datele au fost reunite pentru analiza ulterioară

2.2. Testarea comportamentală

2.2.1. Câmp deschis

Activitatea locomotorie și anxietatea au fost analizate folosind un test în câmp deschis. Șobolanii au fost așezați individual într-o arenă pătrată de dimensiuni de 100 × 100 cm cu un perete înalt de 36 cm împărțit în 25 de pătrate de 20 × 20 cm (Open Science, Moscova, Rusia) echipat cu un sistem video. Șobolanul a fost plasat în centrul câmpului deschis și i s-a permis explorarea aparatului timp de 3 minute cu urmărirea încrucișării pătratului, creșterea, îngrijirea, defecația și activitatea zonei centrale [38]. Fiecărui animal i s-a acordat un scor pentru activitatea locomotorie totală calculată ca suma a traversărilor pătrate și a numărului de spate. După fiecare test, câmpul deschis a fost curățat cu 70% alcool etilic și lăsat să se usuce între teste.

2.2.2. Rezistența musculară

Rezistența musculară a fost evaluată prin testul de rezistență la prinderea labei (PaGE) [39]. Șobolanii au fost așezați pe o rețea de sârmă și agitați ușor pentru a determina șobolanul să prindă rețeaua. Rețeaua a fost răsturnată peste o cușcă și a fost ținută la

0,45 m deasupra unei colivii deschise. Timpul (timpurile) petrecut (ă) pe grilă înainte de cădere a fost evaluat. Cea mai mare valoare din trei studii individuale a fost utilizată pentru analiză.

2.2.3. Testul Rotarod

Testul Rotarod a fost utilizat pentru a evalua coordonarea motorie a membrelor anterioare și posterioare și a echilibrului (Neurobotix, Moscova, Rusia) [40]. Fiecare șobolan a fost așezat pe tijă cu o viteză de rotație de zece rotații pe min (rpm) și s-au măsurat timpul de cădere și distanța de rulare. Animalele sunt supuse la trei sesiuni de testare consecutive (teste) cu un interval de 20-30 min. Cel mai bun din latența de a cădea de pe tija rotativă a fost înregistrat [41].

2.2.4. Task de semințe de floarea-soarelui și test de manipulare a vermișelilor

Sarcina semințelor de floarea soarelui și testul de manipulare a vermișelilor au fost utilizate pentru a evalua controlul motorului fin. În sarcina semințelor de floarea-soarelui a fost estimată capacitatea animalelor de a folosi membrele și cifrele în timpul consumului de semințe de floarea-soarelui [42]. Animalele au fost antrenate timp de trei zile consecutive și în a patra zi comportamentul a fost înregistrat și înregistrat video. În timpul testului șobolanul a fost plasat într-o cutie de plexiglas transparent (50 × 50 × 50 cm) cu cinci semințe de floarea-soarelui în colțul cutiei. S-a înregistrat cantitatea totală de timp pe care șobolanul a petrecut-o manipulând, deschizând și consumând semințe, precum și numărul de bucăți de coajă rămase. Experimentatorul a început să temporizeze momentul în care animalul a atins prima sămânță și a oprit temporizatorul de fiecare dată când animalul a fost distras.

În testul de manipulare a vermișelilor, șobolanilor li s-au dat vermiceli nefiți (lungimi de 7 cm și diametru de 1,5 mm) și au fost observate modele de mișcare asimetrice coordonate ale labelor și gurii. Șobolanii țin cel mai adesea piesa lungă în ambele labe și o mută în gură folosind un model de susținere asimetric coordonat atunci când o lăbuță este utilizată pentru a ține piesa cu o apucare întreagă a labei și cealaltă lavă pentru a ghida piesa în gură, adesea cu vârfurile cifrei [43]. Modelele de comportament atipice au fost evaluate în conformitate cu studiile anterioare [43,44] și au inclus următoarele tipare: (1) Labe sunt simetrice (fără o separare clară a funcțiilor) atunci când se consumă paste lungi; (2) comutarea funcțiilor labelor de la ghidare la înțelegere în timpul mesei; (3) una dintre labe nu intră în contact cu pastele în timpul consumului, ci doar pentru a regla bucata de paste; (4) bucata de paste este scăzută în timpul consumului; (5) gura este folosită pentru a trage bucata de paste prin labele; (6) postura cocoșată, când șobolanul se apleacă peste bucata de pastă și mișcă gura în jos în timp ce bucata devine mai mică. Testul a constat din trei probe cu bucăți de paste date câte unul pe fiecare test. Șobolanul a fost plasat într-o cutie clară de plexiglas și studiile au fost înregistrate video pentru analiză.

2.2.5. Stimulare bilaterală tactilă

Testul de stimulare bilaterală tactilă sau de îndepărtare a adezivului a fost dezvoltat pentru a evalua mișcările/asimetriile senzoriale datorate daunelor nigrostriatale unilaterale sau afectărilor legate de accident vascular cerebral [45]. Șobolanul a fost plasat într-o cutie clară de plexiglas și lăsat să se obișnuiască timp de 1 min. Apoi șobolanul a fost ridicat și o bucată de bandă (1 cm lungime și 3 mm lățime) a fost plasată pe partea ventrală a fiecărei labe. Șobolanul a fost apoi așezat din nou în cutie și i s-a permis să îndepărteze fiecare bucată de bandă cu dinții. Timpul mediu de îndepărtare pentru fiecare stimul a fost calculat utilizând media în trei studii.

2.2.6. Test Light-Dark Box

Un test de cutie de culoare închisă a fost folosit pentru a evalua anxietatea șobolanului. Aparatul de cutie lumină-întuneric (Shelter, Open Science, Moscova, Rusia) este format din două compartimente conectate egal - luminos și întunecat. Rozătoarele preferă zona întunecată și în același timp tind să exploreze noul mediu. Aceste două emoții conflictuale duc la simptome de anxietate observabilă. Șobolanul a fost plasat în compartimentul ușor și a fost lăsat să exploreze aparatul timp de 3 minute. S-au măsurat numărul de intrări și timpul petrecut în compartimentul pentru lumină [46].

2.2.7. T Labirint

Labirintul T a fost utilizat pentru a evalua memoria de lucru spațială într-o sarcină alternativă spontană [47]. Labirintul este realizat din material non-reflexiv și rezistent la mirosuri echipat cu un sistem de urmărire video (Open Science, Moscova, Rusia). Într-un prim proces, șobolanul a fost plasat la punctul de plecare (brațul de pornire în partea de jos a „T”) și a fost permis să exploreze brațul de poartă dreapta sau stânga timp de 3 minute. Odată ce războiul a intrat într-un anumit braț de poartă al joncțiunii „T” dintre brațul de start și brațul de poartă opus a fost închis. Șobolanul a fost lăsat în labirint timp de 30 de secunde pentru a explora brațul țintei, apoi a fost așezat la brațul de start timp de 30 de secunde înainte de a repeta cursa. „Alternanța” a fost luată în considerare dacă șobolanul a intrat în brațul opus în comparație cu cursa anterioară. În pauzele de 10 minute au fost efectuate încă două probe cu două probe. Alternanța în fiecare studiu a fost numărată ca 33,3%, iar în cazul selectării brațului opus în trei studii, șobolanul a obținut 99,9%.

2.2.8. Labirintul de apă Morris

Labirintul de apă Morris este o metodă larg utilizată pentru a studia învățarea și memoria spațială [48]. Labirintul de apă constă dintr-un bazin rotund (1 m în diametru și 0,4 m adâncime) umplut cu apă la 26 ° C în care s-a adăugat lapte uscat negrasit pentru a face apa opacă. Platforma de evacuare a fost plasată într-unul dintre sectoarele bazinului. Șobolanului i s-a permis să înoate și să caute platforma pentru maximum 180 de secunde. Animalul a fost coborât cu grijă în apă. La începutul războiului înota în jurul marginii bazinului în căutarea unei ieșiri. În cele din urmă, animalul a învățat să găsească platforma și s-a urcat pe ea. Timpul petrecut pentru a găsi platforma și traiectoria de înot au fost estimate folosind un sistem de urmărire video. Învățarea a fost evaluată prin timpul de căutare al platformei (latența de evacuare), viteza de înot și distanța în timpul a șase probe consecutive. Pentru a măsura memoria spațială pentru locația anterioară a platformei, probele în care platforma a fost scoasă din bazin au fost efectuate în 1 oră și 24 de ore după ultima încercare de învățare. Am evaluat timpul necesar pentru a ajunge la cadranul țintă în care se afla platforma și numărul relativ de șobolani care înotau în această zonă.

Traiectoria înotului a fost analizată manual și au fost determinate patru tipuri majore de comportamente: tigmotaxie, unde un animal își petrece cea mai mare parte a timpului lângă perete; scanare țintă - scanarea regiunii din jurul platformei; incursiune, unde animalul încă atinge peretele, dar începe să se deplaseze spre interior și să scaneze, unde sunt căutate regiunile mai centrale ale arenei [49].

2.3. Analiza biochimică

2.3.1. Măsurători ale nivelului de homocisteină plasmatică

Nivelul total de homocisteină din plasmă a fost determinat prin detecție electrochimică folosind electrozi modificați cu nano-carbon așa cum s-a descris anterior [50,51].

2.3.2. Testarea generației H2S

Sulfura totală ca marker relativ al concentrației H2S și testele de generare a H2S au fost efectuate utilizând metoda sulfatului de N, N-dimetil-p-fenilendiamină (NNDPD) [52]. Țesuturile cerebrale ale șobolanilor P72-90 au fost omogenizate în soluție de NaCI 0,15 M răcită cu gheață tamponată cu fosfat. Omogenatul (10%, 860 uL) a fost amestecat cu acetat de zinc (1%, 500 uL) și 0,15 M NaCI (140 uL) la temperatura camerei. S-a adăugat acid tricloracetic (10%, 500 pl) pentru a opri reacția și acetat de zinc (1%, 500 pl) pentru a prinde H2S. Pentru a evalua rata producției de H2S omogenatul sondei (10%, 860 µL) a fost amestecat cu L-cisteină (10 mM, 40 µL), piridoxal 5'-fosfat (2 mM, 40 µL) și soluție salină (60 și incubat la 37 ° C timp de 60 min. S-au administrat acid tricloracetic și acetat de zinc pentru a prinde H2S produs.

În ambele cazuri sondele au fost amestecate cu NNDPD (20 mM, 266 µL) în HCI 7,2 M și FeCl3 (30 mM, 266 µL) în HCI 1,2 M și absorbția alicotelor soluției rezultate (600 µL) a fost măsurată la 670 nm de spectrofotometrie (PE-5300VI, ECOHIM, Saint Petersburg, Rusia). Concentrațiile totale de sulfură au fost calculate în raport cu o curbă de calibrare a NaHS. Activitatea de sinteză a H2S este exprimată ca HM H2S produs de 1 g de țesut pe minut (µM/min/g).

2.3.3. Peroxidarea lipidelor și activitatea peroxidazelor glutationului

Probele de țesut cerebral au fost înghețate și omogenizate în soluție tampon (0,15 M NaCI cu tampon fosfat, raport 1:10) pentru analize suplimentare. Malondialdehida (MDA) a fost măsurată spectrofotometric conform metodei lui Ohkawa și colab. 1979 [53]. Omogenatele țesutului cerebral au fost amestecate cu acid tricloracetic 20% și acid 2-tiobarbituric 0,03 M într-un raport de 2: 2: 1. Amestecul a fost încălzit timp de 45 min la 95 ° C și centrifugat timp de 10 minute la 10.000 g. În această condiție, MDA participă cu ușurință la o reacție de adiție nucleofilă cu acid 2-tiobarbituric, generând un aductiv MDA roșu, fluorescent 1: 2. Absorbanța supernatantului a fost monitorizată la 532 nm (εTBA-MDA = 1,55 mM -1 cm -1) prin spectrofotometrie (PE-5300VI, ECOHIM, Saint Petersburg, Rusia). Nivelurile de MDA au fost exprimate ca pg/g de țesuturi.

Potențialul antioxidant a fost determinat prin măsurarea activității glutation peroxidazei (GPx) evaluată prin scăderea nivelului redus al formei glutationului (GSH) folosind terț-butil ca substrat [54]. Un ml de soluție de glutation s-a amestecat cu 1 ml de omogenizat cerebral; amestecul a fost împărțit în două tuburi de centrifugă (test și control) și incubat timp de 5 minute. Soluția de hidroperoxid de terț-butil (5 μM, 0,02 ml) a fost adăugată la eprubetă. După 10 min, s-au turnat 0,2 ml de acid tricloracetic rece 10% în tuburile de testare și martor. Probele au fost centrifugate timp de 15 minute la 10.000 g și 0,1 ml de supernatant din martor și eprubetele au fost transferate în tuburile chimice și s-au adăugat și amestecat 2 ml de tampon fosfat (pH 8,0) și 0,05 ml reactiv Ellman. Densitatea optică a probelor de control și de testare a fost măsurată la 412 nm cu ajutorul unui spectrofotometru (PE-5300VI, ECOHIM, Saint-Petersburg, Rusia). Activitatea GPx a fost exprimată ca pg/g de țesuturi pe min.

2.4. Western Blot

2.5. Analize statistice

3.2. Efectele hHcy materne și NaHS asupra comportamentului în testul câmpului deschis

Activitatea locomotorie și exploratorie a fost evaluată în cadrul testului în câmp deschis. Activitatea orizontală (încrucișarea pătratului) a fost semnificativ mai mare în grupul Hcy comparativ cu grupurile martor și NaHS (Figura 2 a). Numărul de pătrate încrucișate de șobolani din grupul NaHS nu a fost diferit de grupul martor (Figura 2a). Activitatea de creștere sau verticală a șobolanilor nu a fost diferită în toate grupurile (8,7 ± 1,2 în control; 11,1 ± 0,6 în Hcy; 8,4 ± 0,9 în NaHS; 9,6 ± 1,1 în grupurile HcyNaHS), cu toate acestea, activitatea locomotorie totală a fost semnificativ mai mare în Grupul Hcy comparativ cu grupurile martor și NaHS (Figura 2 b).

3.3. NaHS scade nivelul de anxietate măsurat în cutia de lumină-întuneric la șobolani cu sănătate maternă

Testul cutiei întunecate deschise creează o situație conflictuală pentru un animal care tinde să exploreze o zonă necunoscută și timpul petrecut în compartimentul întunecat se corelează cu nivelul de anxietate [46]. În grupul de control, timpul petrecut în compartimentul pentru lumină a fost de 88,4 ± 7,1 s (n = 25) și a scăzut semnificativ în grupul Hcy (62,5 ± 8,4 s, n = 25, Figura 3 a). În grupurile NaHS și HcyNaHS, acest parametru nu a fost semnificativ diferit de grupul de control. Rezultate similare au fost obținute pentru numărul de tranziții între camere (Figura 3 b).

Efectele tratamentului prenatal hHcy și NaHS asupra anxietății măsurate în cutia de lumină-întuneric. Timpul petrecut în cutia de lumină (A) și numărul de tranziție între camere (b) de șobolani în comparație cu grupurile de control (coloane albe), Hcy (coloane gri), NaHS (coloane punctate), HcyNaHS (coloane punctate gri). * p # n Figura 4 a). În grupul Hcy, acest timp a fost semnificativ mai mic comparativ cu grupul martor (44,1 ± 5,8 s, p Figura 4 a). Coordonarea motorie a fost evaluată în testele Rotarod, unde s-au măsurat timpul de cădere și distanța de rulare [41]. Modificări similare au fost observate în grupul Hcy pentru distanța Rotarod în timpul sesiunilor experimentale (Figura 4 b). O reducere semnificativă a timpului petrecut pe Rotarod a fost observată în grupul Hcy comparativ cu grupul martor (Figura 4 c). Tratamentul cu NaHS a restabilit ambele valori de control (Figura 4 b, c).