• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

Abstract

Introducere

În acest studiu, ne-am propus să înțelegem procesele care stau la baza transferului hepatocitelor glucuronide sorafenib, excreția biliară și reciclarea intestinală utilizând modele in vitro și in vivo și, astfel, să elucidăm mecanismele care contribuie la variabilitatea farmacocinetică interindividuală a sorafenibului.

hepatocelular

Materiale și metode

Transportul vezicular in vitro

Veziculele din celulele Sf9 (Life Technologies) care exprimă șoarece Abcc2 (mAbcc2), șobolan Abcc2 (rAbcc2), ABCC2 uman (ABCC2), ABCC3 uman (ABCC3) sau ABCC4 uman (ABCC4) au fost incubate cu sorafenib (10 μmol/L; Chemie Tek) sau SG (10 μmol/L) timp de 5 minute în prezența sau absența ATP (4 mmol/L) sau rifampicină (100 μmol/L), apoi lizate cu 0,1 mol/L HCl și analizate prin cromatografie lichidă- spectrometrie de masă tandem (LC/MS-MS; ref. 20). Transportul dependent de ATP al sorafenibului și SG a fost determinat prin scăderea transportului dependent de AMP din transportul dependent de ATP, ambele exprimate în pmol/min/mg, după normalizarea transportului nespecific observat în veziculele martor. Experimentele de captare au fost efectuate la o concentrație de 10 μmol/L, care este echivalentă cu concentrațiile medii de starea de echilibru plasmatică de sorafenib realizabile la adulți și copii tratați cu 400 mg sau 200 mg/m2 de două ori pe zi (9, 21).

Animale

Șoarecii Abcc4 -/- pe un fundal C57BL/6 au fost generați și crescuți intern la St. Jude Children's Research Hospital (Memphis, TN) și șoareci Abcc2 -/- pe un fundal FVB au fost furnizate de Taconic. Toate celelalte tulpini knock-out pe un fundal FVB au fost generate și crescute intern la Institutul Olandez al Cancerului (Amsterdam, Olanda). Analizele PCR în timp real au demonstrat că expresia transportatorilor relevanți de medicamente nu s-a modificat substanțial în niciuna dintre aceste tulpini knock-out (Tabelul suplimentar S1). Prin urmare, a fost exclusă posibilitatea unor modificări compensatorii majore în expresia transportorului care afectează interpretarea rezultatelor. Șobolani Abcc2 -/- pe un fundal Sprague-Dawley au fost obținuți de la Sage Labs. Șoarecii și șobolanii au fost adăpostiți într-un mediu controlat de temperatură, cu un ciclu de lumină de 12 ore și li s-a dat o dietă standard și apă ad libitum. Experimentele au fost aprobate de Comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor din St. Spitalul de cercetare pentru copii Jude și Institutul olandez al cancerului.

Studii farmacocinetice plasmatice

Farmacocinetica sorafenibului și SG la șoareci de tip sălbatic și Abcc2 -/-. Concentrația plasmatică - profiluri de timp (A și D) și raportul ficat-plasmă (B și E) ale sorafenibului și respectiv SG, la șoareci femele de tip sălbatic și Abcc2 -/-. Sorafenib a fost administrat pe cale orală la o doză de 10 mg/kg. Ficatele au fost luate la 2 și 7,5 ore după administrarea sorafenibului (n = 4 per grup). Concentrațiile în ficat (CL) au fost normalizate la concentrațiile corespunzătoare în plasmă (Cp). C și F, raporturi de concentrație bilă-plasmă ale sorafenibului și respectiv SG, la șoareci de tip sălbatic și Abcc2 -/-. Sorafenib (10 mg/kg) a fost administrat oral cu 30 de minute înainte de începerea colectării bilei (N = 3 de tip sălbatic; N = 2 șoareci Abcc2 -/-). Bilele au fost colectate timp de 2 ore. Datele reprezintă media ± SE.

ABCC2 mediază excreția biliară a SG

Pentru a determina dacă aceste fenotipuri au fost observate și la o altă specie, farmacocinetica sorafenibului a fost evaluată la șobolanii de tip sălbatic și Abcc2 -/-. Deficitul de Abcc2 la șobolani a dus la o creștere de aproximativ 2 ori a nivelului plasmatic atât al sorafenibului (Fig. 3A), cât și al sorafenib-N-oxidului (Fig. 3B). Totuși, în mod neașteptat, SG nu a fost detectat în plasmă sau bilă, nici de șobolan de tip sălbatic, nici de Abcc2 -/- (fig. 3C) Studiile de metabolism ex vivo au indicat faptul că, comparativ cu șoarecii și oamenii (9), microsomii ficatului de șobolan nu au o capacitate semnificativă de a forma SG (Fig. 3D). Aceste rezultate indică faptul că șobolanul este un model inadecvat pentru farmacocinetica umană a sorafenibului. Mai mult, implicarea ABCC2 în transportul sorafenibului nemodificat poate deveni din ce în ce mai importantă atunci când glucuronoconjugarea este defectă, posibilitate care este în concordanță cu datele clinice recente (10). Colectiv, datele indică faptul că excreția biliară a SG este mediată în principal de ABCC2 și, prin urmare, este un factor determinant important al farmacocineticii SG.

Transportul sinusoidal al SG este afectat de deficiența Abcc2 și Abcc3

Dispunerea sorafenibului a fost apoi evaluată la șoareci Oatp1a/1b; Abcc2 -/- și Oatp1a/1b; Abcc2; Abcc3 -/-. În conformitate cu constatările noastre la șoarecii unici Abcc2 -/-, am constatat că ștergerea Abcc2 în combinație cu ștergerea Oatp1a/1b a dus la o creștere foarte mare a expunerii plasmatice a SG în comparație cu șoarecii de tip sălbatic (909 ori), dar și în comparație cu șoarecii Oatp1a/1b -/- (de 12,7 ori; Fig. 4D; Tabelul suplimentar S2). La 2 ore, nivelurile hepatice ale SG au fost de 1,8 ori mai mari la șoarecii Oatp1a/1b; Abcc2 -/- în comparație cu șoarecii de tip sălbatic (Fig. 4E). Ca urmare a nivelurilor plasmatice crescute de SG, raporturile ficat-plasmă au scăzut la toți șoarecii knockout transportori, comparativ cu șoarecii de tip sălbatic (Fig. 4F). Aceste descoperiri susțin un rol important pentru Abcc2 în excreția biliară a SG și că ștergerea Abcc2 în plus față de deficiența de Oatp1a/1b duce la o creștere majoră a extruziunii sinusoidale a acestui metabolit înapoi în circulație.

Am constatat că expunerea la plasmă SG a fost redusă cu 30% la șoareci Oatp1a/1b; Abcc2; Abcc3 -/- în comparație cu șoareci Oatp1a/1b; Abcc2 -/- (Fig. 4D). Impactul Abcc3 în ficat a rămas vizibil cu o creștere de 1,5 ori a nivelurilor absolute de SG în ficat (Fig. 4E) și o creștere de 1,7 ori a raporturilor ficat-plasmă (Fig. 4F) la 2 ore în Oatp1a/1b; Abcc2; Abcc3 -/- șoareci comparativ cu Oatp1a/1b; Abcc2 -/- șoareci. Concentrațiile plasmatice și hepatice ale sorafenibului nu au fost modificate substanțial în aceste tulpini (Fig. S3C și S3D suplimentare). Colectiv, aceste descoperiri indică faptul că Abcc3 are un impact clar asupra secreției sinusoidale a SG și, în combinație cu capacitatea demonstrată anterior de Oatp1a/1b de a prelua SG de-a lungul membranei sinusoidale, poate avea ca rezultat „saltul hepatocitelor” acestui medicament conjugat. Cu toate acestea, există și alți transportori de eflux sinusoidal parțial redundant pentru SG care limitează impactul absolut al deficienței de Abcc3 la șoareci, poate mai ales la nivelurile ridicate de SG ale hepatocitelor cauzate de alterarea excreției biliare prin Abcc2.

Deconjugarea SG prin β-glucuronidaze intestinale de șoarece

Pentru a evalua soarta SG secretată de Abcc2 în bilă, am efectuat apoi studii de incubare ex vivo ale conținutului intestinal (cecal) de șoarece pe baza considerației că odată ajuns în intestine, SG poate servi ca substrat pentru enzimele β-glucuronidazei bacteriene. care sunt produse de bacterii care locuiesc în mod normal în intestine (30). Îndepărtarea grupării glucuronide din SG de către β-glucuronidază generează o sursă de carbon pentru bacterii și, în acest proces, SG este reactivat înapoi la sorafenibul activ din punct de vedere farmacologic. Pe o perioadă de 6 ore într-o suspensie brută de conținut de cecal, am observat o scădere dependentă de timp a nivelurilor SG și o creștere corespunzătoare a sorafenibului (Fig. 5A). Pretractarea termică a probelor de cecal la 65 ° C a dus la abrogarea formării de sorafenib, indicând faptul că deconjugarea SG este un proces mediat de enzime. Mai mult, am constatat că formarea sorafenibului din SG a fost redusă de aproximativ 3 ori în probele de cecal de la șoareci care fuseseră pretratați cu neomicină pentru a elimina flora intestinală (Fig. 5B; ref. 31). Această constatare este în concordanță cu presupunerea că β-glucuronidazele produse de microbiota intestinală sunt responsabile pentru deconjugarea SG la sorafenib.

Formarea de Sorafenib din SG prin conținutul intestinal al șoarecelui. A și B, formarea sorafenibului la incubarea ex vivo a conținutului de cecal de șoarece FVB cu SG (2 μmol/L) cu sau fără pretratament termic (65 ° C; A) sau după tratamentul șoarecilor cu soluție salină sau neomicină orală 200 mg kg administrat de două ori pe zi timp de 5 zile (n ≥ 4/grup; B). Datele au fost normalizate la concentrația SG la t = 0 și reprezintă media ± SE. C, concentrațiile plasmatice de sorafenib la șoareci pretratați cu neomicină orală (200 mg/kg) administrate de două ori pe zi timp de 5 zile. În ziua recoltării probelor de sânge, SG (10 mg/kg) a fost administrat pe cale orală. Sorafenib nu a fost detectat în plasmă decât la 8 ore după administrarea SG. Toate animalele au fost șoareci femele FVB. Datele reprezintă media ± SE.

În concluzie, acest studiu arată că o buclă sinusoidală de transfer hepatic la sânge pentru SG este formată de Oatp1a/1b, Abcc3 și probabil de un alt transportor de eflux sinusoidal. Astfel, pe lângă metaboliții glucuronidici endobiotici precum BG, xenobioticele care suferă glucuronoconjugare hepatică pot fi, de asemenea, supuse aceluiași proces de sărituri hepatocitare, în funcție de afinitatea relativă a acestor compuși pentru transportorii de eflux sinusoidal și canalicular, cum ar fi Abcc2 (Fig. 6) . Având în vedere specificul larg al substratului acestor transportori, ne așteptăm ca rezultatele noastre să fie relevante pentru multe alte glucuronide xenobiotice. Aceste constatări sugerează, de asemenea, că factorii care interferează cu transferul hepatocelular, excreția biliară și/sau deconjugarea intestinală a SG vor avea un impact major asupra expunerii sistemice la sorafenib și vor contribui probabil la variabilitatea farmacocinetică substanțială interindividuală observată cu sorafenib și alți inhibitori ai tirozin kinazei care suferă glucuronidare și recirculare enterohepatică, cum ar fi regorafenib (33).

Saltul hepatocitelor și recircularea SG. După administrarea orală, sorafenib intră în hepatocite prin mecanisme de transport incomplet definite, incluzând purtători de tip OATP1B și OCT1, și suferă metabolizare mediată de CYP3A4 la sorafenib-N-oxid (s-N-oxid) și conjugare de către UGT1A9 pentru a forma SG. După conjugare, SG este secretat extensiv în bilă printr-un proces care este mediat în principal de ABCC2. În condiții fiziologice, o fracțiune din SG intracelular este secretată de ABCC3 și cel puțin un alt transportor înapoi în sânge, de unde poate fi preluată din nou în hepatocite din aval prin intermediul purtătorilor de tip OATP1B1 (Oatp1a și Oatp1b la șoareci). Această buclă de secreție și recaptare poate preveni saturația excreției biliare mediate de ABCC2 în hepatocitele din amonte, asigurând astfel eliminarea biliară eficientă și detoxifierea hepatocitelor. Odată secretat în bilă, SG pătrunde în lumenul intestinal unde servește ca substrat pentru β-glucuronidaze bacteriene încă necunoscute (βGLU) care produc sorafenib, care ulterior suferă absorbție intestinală și reintră în circulația sistemică.

Dezvăluirea potențialelor conflicte de interese

S. Mani este consultant/membru al consiliului consultativ pentru Symberix. AH. Schinkel raportează că a primit un alt sprijin de cercetare comercială pentru laboratorul Schinkel din distribuția comercială a unor tulpini de șoareci utilizate în acest studiu. Nici un potențial conflict de interese nu a fost dezvăluit de către ceilalți autori.

Declinare de responsabilitate

Conținutul este exclusiv responsabilitatea autorilor și nu reprezintă neapărat opiniile oficiale ale agențiilor de finanțare.

Contribuțiile autorilor

Concepție și proiectare: S. Durmus, S. Mani, A. Sparreboom, S.D. Baker, A.H. Schinkel

Dezvoltarea metodologiei: A. Vasilyeva, E. Wagenaar, S. Hu, A.A. Gibson, S.D. Brutar

Achiziționarea de date (animale furnizate, pacienți dobândiți și gestionați, facilități furnizate etc.): A. Vasilyeva, S. Durmus, L. Lee, E. Wagenaar, S. Hu, A.A. Gibson, S.D. Brutar

Analiza și interpretarea datelor (de exemplu, analiză statistică, biostatistică, analiză de calcul): A. Vasilyeva, S. Durmus, S. Hu, A.A. Gibson, J.C. Panetta, S. Mani, A. Sparreboom, S.D. Baker, A.H. Schinkel

Scrierea, revizuirea și/sau revizuirea manuscrisului: A. Vasilyeva, S. Durmus, S. Hu, A.A. Gibson, J.C. Panetta, S. Mani, A. Sparreboom, S.D. Baker, A.H. Schinkel

Suport administrativ, tehnic sau material (adică raportarea sau organizarea datelor, construirea bazelor de date): E. Wagenaar, S. Hu, A.A. Gibson, J.C. Panetta, S. Mani

Supravegherea studiului: S.D. Baker, A.H. Schinkel

Altele (generarea de idei): S. Mani

Acordați sprijin

Această lucrare a fost susținută, în parte, de organizațiile de caritate asociate siriene libaneze americane (ALSAC), Grantul de sprijin al Centrului pentru Cancer USPHS 3P30CA021765 (S.D. Baker) și Granturile NCI 5R01CA138744 (S.D. Baker) și 1R01CA161879 (S. Mani).

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, acest articol trebuie marcat publicitar în conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc Dr. John D. Schuetz pentru furnizarea șoarecilor C57BL/6 Abcc4 -/-.