Katsuhisa Omagari 1.2, Kazuhito Suruga 1.2, Akira Kyogoku 1, Satomi Nakamura 1, Ai Sakamoto 1, Shinta Nishioka 2, Mayuko Ichimura 2, Yuji Miyata 3, Koichi Tajima 4, Koichi Tsuneyama 5, Kazunari Tanaka 1.2

Contribuții: (I) Concepție și proiectare: K Omagari, K Tanaka; (II) Sprijin administrativ: K Omagari, K Suruga, K Tsuneyama, K Tanaka; (III) Furnizarea de materiale de studiu sau pacienți: Y Miyata, K Tajima; (IV) Colectarea și asamblarea datelor: K Suruga, A Kyogoku, S Nakamura, A Sakamoto, S Nishioka, M Ichimura, K Tsuneyama; (V) Analiza și interpretarea datelor: K Omagari, K Suruga, Y Miyata, K Tajima, K Tsuneyama; (VI) Scrierea manuscriselor: Toți autorii; (VII) Aprobarea finală a manuscrisului: Toți autorii.

Fundal: Tratamentele stabilite pentru steatohepatita nealcoolică (NASH) sunt puține, prin urmare este imperativ să se dezvolte noi strategii dietetice care pot preveni NASH. Un ceai mixt fermentat (FMT) preparat cu Camellia japonica (camelia japoneză) și frunze de ceai verde din a treia recoltă prin procesarea rulării ceaiului a fost raportat pentru a reduce greutatea corporală și greutatea țesutului adipos la șobolanii Sprague-Dawley (SD). Deoarece grăsimea viscerală este unul dintre cei mai importanți factori pentru dezvoltarea steatozei hepatice, această suplimentare FMT poate fi o strategie dietetică candidată pentru prevenirea NASH.

Metode: Șobolanii masculi SD în vârstă de nouă săptămâni au fost hrăniți cu diete bogate în grăsimi și colesterol ridicat (HFC) cu sau fără FMT (camelie și frunze de ceai verde recoltate la treia proporție de 1: 5, 1: 2 și 1: 1) timp de 9 săptămâni (n = 6-7/grup). Au fost evaluate histopatologia, serologia și expresiile genelor hepatice fibrogenetice, proinflamatorii, oxidative și ale metabolismului lipidic.

Rezultate: Din punct de vedere histologic, dieta HFC cu FMT la un raport de 1: 5 a redus dramatic progresia NASH (14%) comparativ cu dieta HFC fără FMT (100%). FMT la un raport de 1: 5 steatoza hepatică redusă datorită activării proteinei de transfer trigliceridic microsomal și FMT la un raport de 1: 2 niveluri reduse de mARN ale unor gene marker de stres oxidativ, fibrogen și proinflamator, legate de metabolismul lipidic.

Concluzii: Datele noastre sugerează că FMT la un raport de 1: 5 sau 1: 2 are probabil un efect preventiv asupra progresiei NASH.

Cuvinte cheie: Frunze de camelie; frunze de ceai verde; ceai fermentat; steatohepatită nealcoolică; dieta bogată în grăsimi și colesterol ridicat (HFC)

Trimis la 24 mai 2017. Acceptat pentru publicare 07 august 2017.

Introducere

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) este recunoscută ca fiind cea mai frecventă cauză a bolilor hepatice cronice în multe țări. În majoritatea cazurilor, NAFLD nu progresează dincolo de ficatul gras nealcoolic (NAFL), dar ficatul prezintă ocazional fibroză și necroinflamare, indicând prezența steatohepatitei nealcoolice (NASH) (1). Pe baza ipotezei „două lovituri” sau „lovituri paralele multiple” a patogenezei NASH (2,3), rezistența la insulină, stresul oxidativ și activarea citokinelor inflamatorii par a fi caracteristici cheie în tranziția de la NAFL la NASH (4). Prin urmare, modificările obiceiurilor alimentare și ale stilului de viață au fost recomandate ca standard de îngrijire pentru NAFLD; cu toate acestea, aceste strategii comportamentale au o rată mare de eșec (4).

Oxidarea catechinelor din frunzele de ceai verde are ca rezultat formarea polifenolilor de ceai negru, cum ar fi theaflavins și theasinensins. S-a raportat că acești polifenoli au efecte hipocolesterolemiante și hipotriacilglicerolemice la șobolanii hrăniți cu colesterol (11). Cai și colab. a raportat că un extract de ceai negru fermentat (ceai Pu-erh) a ameliorat NASH indusă de dietă bogată în grăsimi, îmbunătățind metabolismul lipidic, inflamația și rezistența la insulină (12).

În studiul de față, am evaluat efectul preventiv al acestui FMT împotriva NASH la șobolanii Sprague-Dawley (SD) hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi și colesterol ridicat (HFC). De asemenea, am investigat mecanismul care stă la baza efectelor FMT, concentrându-ne în mod specific pe modificările fibrogenezei, inflamației, stresului oxidativ și metabolismului colesterolului sau lipidelor în ficat.

Metode

Animale și design experimental

Șobolani masculi SD de opt săptămâni au fost achiziționați din Japan SLC (Hamamatsu, Japonia) și adăpostiți individual într-o cameră controlată de temperatură și umiditate (22-24 ° C și 50-60% umiditate relativă) cu o lumină de 12 ore/ciclu întunecat. După 1 săptămână de aclimatizare cu chow de rozătoare standard (MF; drojdie orientală, Tokyo, Japonia) și apă ad libitum, șobolanii au fost împărțiți în mod aleatoriu în cinci grupuri: grupul de control (n = 6), hrănit cu chow de rozătoare standard (MF) ca dieta normala timp de 9 saptamani; Grup HFC (n = 6), alimentat cu o dietă HFC timp de 9 săptămâni; Grup FMT1: 5 (n = 7), hrănit cu o dietă HFC suplimentată cu 1% (greutate/greutate) FMT (FMT) realizată cu camelie (Camellia japonica) și frunze de ceai verde din a treia cultură la un raport de 1: 5 pentru 9 săptămâni; FMT1: grup 2 (n = 6), alimentat cu o dietă HFC suplimentată cu 1% (greutate/greutate) FMT la un raport de 1: 2 timp de 9 săptămâni; și grupul FMT1: 1 (n = 7), alimentat cu o dietă HFC suplimentată cu 1% FMT într-un raport de 1: 1 timp de 9 săptămâni. Dieta HFC a fost preparată prin amestecarea MF cu 30% (gr/gr) ulei de palmier, 1,25% (gr/gr) colesterol și 0,5% (gr/gr) colat de sodiu (16,17). FMT au fost furnizate de stația de experimentare agricolă și forestieră din prefectura Nagasaki, filiala de ceai Higashisonogi, Nagasaki, Japonia, după cum sa descris anterior (15). Compozițiile dietetice proximale ale fiecărei diete hrănite la șobolani sunt prezentate în Tabelul 1. Aportul zilnic de energie și greutatea corporală au fost monitorizate pe tot parcursul studiului.

camellia

La vârsta de 18 săptămâni, șobolanii au fost posti timp de 8 ore și sacrificați sub anestezie cu sodiu pentobarbital. Organele au fost recoltate și sângele a fost colectat din vena cavă inferioară. Țesuturile hepatice au fost fie plasate în formalină tamponată 10% neutră, fie congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C.

Evaluarea histopatologică a ficatului

Țesuturile hepatice depozitate în 10% formalină tamponată neutră au fost încorporate în parafină, secționate la 4 μm și prelucrate pentru colorarea hematoxilin-eozinei (HE) pentru examen histopatologic. Steatoza histologică [0-3], inflamația lobulară [0-3] și balonarea hepatocitelor [0-2] au fost evaluate semicantitativ pentru a determina scorul de activitate NAFLD (NAS) conform criteriilor propuse de Kleiner și colab. (18). Valorile finale ale NAS au variat de la 0 la 8. Scorurile NAS ≥5 și ≤2 au fost considerate diagnostice și nu diagnostice, respectiv, pentru steatohepatită. Fibroza hepatică [0-4] a fost, de asemenea, evaluată prin colorarea Azan. Fiecare specimen a fost, de asemenea, atribuit unuia dintre cele patru subgrupe histopatologice: tip 1, ficat gras singur; tip 2, acumularea de grăsime și inflamația lobulară; tip 3, acumularea de grăsime și degenerarea cu baloane; tipul 4, acumularea de grăsime, degenerarea cu balon și fie hialină sau fibroză Mallory, conform criteriilor propuse de Matteoni și colab. (19). Toate examinările histopatologice au fost efectuate de un patolog (K.T.) care a fost orbit de datele experimentale și serologice.

Analiza biochimică serică

Trigliceridele serice (TG), colesterolul total (TC), glucoza, aspartatul aminotransferază (AST) și alanina aminotransferaza (ALT) au fost determinate prin testul Trigliceridei E Wako, testul Colesterolului E Wako, testului Glucozei C II Wako și testului Transaminazei C II Wako (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia), respectiv. Nivelurile serice de insulină, leptină și adiponectină au fost măsurate folosind un kit de testare imunosorbentă legată de enzima insulinei de șobolan (ELISA) (Institutul Morinaga de Științe Biologice Inc., Yokohama, Japonia) și kitul ELISA de leptină de șoarece/șobolan (Institutul de Științe Biologice Morinaga ) Inc.) și un kit ELISA pentru adiponectină de șoarece/șobolan (Otsuka Pharmaceuticals Co., Ltd., Tokyo, Japonia), respectiv.

Cuantificarea ARNm utilizând PCR în timp real

analize statistice

Toate valorile au fost exprimate ca medie ± eroare standard (SE). Diferențele dintre grupuri au fost testate pentru semnificația statistică folosind analiza unică a varianței (ANOVA), urmată de testul post-hoc al lui Scheffe, testul chi-pătrat sau testul de probabilitate exact al lui Fisher. Toate analizele au fost efectuate utilizând programul software statistic IBM SPSS, versiunea 23 (IBM Co., Somers, NY, SUA) pe un computer Windows. O valoare P mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă statistic.

Rezultate

Aportul cumulativ de energie, greutatea corporală și greutatea relativă a organelor

Aportul cumulativ de energie a fost semnificativ mai mare în grupurile HFC, FMT1: 5, FMT1: 2 și FMT1: 1 decât grupul de control (P

Discuţie

Tratamentele stabilite pentru NAFLD/NASH sunt puține, deci este vital să se dezvolte și să se valideze noi strategii dietetice pentru a preveni sau atenua dezvoltarea steatozei hepatice și progresia acesteia către NASH (6). În prezentul studiu, dieta HFC suplimentată cu FMT la un raport de 1: 5 a redus dramatic progresia NASH (14%) diagnosticată în funcție de NAS (18) comparativ cu dieta HFC fără FMT (100%). Nivelurile serice de glucoză nu au diferit semnificativ între grupuri, dar nivelurile serice de insulină au avut tendința de a fi mai mici în grupurile FMT într-o manieră dependentă de doză de extractul de ceai verde comparativ cu grupul HFC, sugerând că frunzele de ceai verde reduc rezistența la insulină. Nivelurile serice de leptină au avut, de asemenea, tendința de a fi mai mici în grupurile FMT într-o manieră dependentă de doză de extract de ceai verde, comparativ cu grupul HFC. Rezistența la insulină este un eveniment timpuriu care duce la NASH (7), iar un nivel ridicat de leptină serică poate contribui la inflamația hepatică și fibroza în NAFLD (20). Prin urmare, FMT la un raport de 1: 5 poate avea un efect preventiv asupra progresiei NASH.

În grupul FMT1: 5, scorurile histopatologice ale steatozei au fost mai mici comparativ cu grupul HFC din prezentul studiu. Acest rezultat s-a datorat parțial sintezei și excreției lipoproteinelor cu densitate foarte mică din ficat, deoarece nivelurile de ARNm ale MTP au avut tendința de a fi mai mari în grupul FMT1: 5 decât grupul HFC, deși diferența nu a fost semnificativă statistic. De asemenea, nivelurile de ARNm ale MnSOD, un marker de stres oxidativ, au avut tendința de a fi mai mici în grupul FMT1: 5 decât grupul HFC, deși diferența nu a fost semnificativă statistic. Cu toate acestea, nivelurile de ARNm ale genelor proinflamatorii, inclusiv MCP-1, IL-1β, IL-6 și NF-κB, și gena fibrogenetică α-SMA tindeau să fie mai mari în grupul FMT1: 5 decât grupul HFC. Aceste rezultate au fost incompatibile cu scorurile histopatologice inferioare ale inflamației lobulare.

Pe de altă parte, dieta HFC suplimentată cu FMT la rapoarte de 1: 2 și 1: 1 nu a evidențiat efecte evidente asupra prevenirii NASH (67% și, respectiv, 86%) diagnosticate în funcție de NAS (16) comparativ cu alimentarea cu HFC șobolani (100%) în prezentul studiu. Cu toate acestea, nivelurile de ARNm ale genelor proinflamatorii, inclusiv TNF-α, IL-1β, IL-6 și NF-κB, precum și genele FAS și AOX legate de metabolismul lipidic au avut tendința de a fi mai mici în grupul FMT1: 2 decât grupul HFC. Mai mult, nivelurile de ARNm ale genelor fibrogene COL1A1 și α-SMA, precum și genele marker de stres oxidativ HO-1 și MnSOD au avut, de asemenea, tendința de a fi mai mici în grupul FMT1: 2 decât grupul HFC. Aceste rezultate pot sugera că FMT la un raport de 1: 2 poate avea, de asemenea, un potențial efect preventiv asupra progresiei NASH.

Concluzii

În prezentul studiu, FMT la un raport de 1: 5 sau 1: 2 a avut probabil un efect preventiv asupra progresiei NASH. FMT la un raport de 1: 5 a redus steatoza hepatică datorită activării MTP și FMT la un raport de 1: 2 a redus nivelurile de ARNm ale unor gene marker de stres oxidativ, fibrogen și oxidativ proinflamator, legate de metabolismul lipidic, a sugerat că FMT a avut un efect preventiv asupra progresiei NASH. În lumina rezultatelor conflictuale dintre analiza histopatologică și cea a expresiei genice, sunt necesare studii suplimentare pentru a elucida pe deplin mecanismul (mecanismele) responsabil (e).

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de un program de promovare a cercetării științei și tehnologiei pentru agricultură, silvicultură, pescuit și industria alimentară (proiecte de cercetare și dezvoltare pentru aplicarea în promovarea unei noi politici agricole, silvice și piscicole).

Notă de subsol

Conflict de interese: Autorii nu au conflicte de interese de declarat.

Declarație etică: Toate procedurile efectuate pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru utilizare animalelor din Universitatea din Nagasaki (nr. 27-14), iar animalele au fost întreținute în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, Universitatea din Nagasaki.