1 Departamentul de Bioinginerie, Universitatea Medicală Zunyi, Campusul Zhuhai, Zhuhai, Guangdong, 519041, China

decoct

2 Gansu Institute for Drug Control, Lanzhou, Gansu, 730070, China

3 Laboratorul cheie Shenzhen pentru resurse comestibile și medicinale, SRI, Universitatea de Știință și Tehnologie din Hong Kong, Shenzhen, 518057, China

4 Divizia de Științe ale Vieții, Centrul de Medicină Chineză, Universitatea de Știință și Tehnologie din Hong Kong, Clear Water Bay, Hong Kong

5 Departamentul de biologie, Universitatea Hanshan Normal, Chaozhou, Guangdong 521041, China

Abstract

1. Introducere

Obezitatea este caracterizată ca țesuturi adipoase anormale sau excesiv acumulate, despre care se crede că sunt induse de mai mulți factori, inclusiv genetic și ecologic. Incidența obezității crește și devine un fenomen normal atât în ​​țările în curs de dezvoltare, cât și în țările dezvoltate, ceea ce reprezintă o mare provocare pentru profesioniștii din domeniul sănătății. Persoanele obeze ar putea suferi riscuri ridicate de anomalii metabolice, diabet și mai multe tipuri de boli de cancer [1, 2]. Tratamente terapeutice anti-obezitate au fost propuse de zeci de ani. Limitarea aportului de carbohidrați se credea cea mai eficientă strategie pentru antiobezitate; cu toate acestea, sa raportat că acest tratament are un impact negativ asupra dezvoltării mentale [3, 4]. Pe de altă parte, efectele secundare ale medicamentelor sintetice populare pentru slăbit, de exemplu, fentermină-topiramat și lorcaserin, ameliorează în mod obișnuit riscurile sindromului hepatorenal și duc la reducerea calității vieții pacientului [5].

Există două tipuri de țesuturi adipoase găsite în corpul uman, adică țesuturile adipoase albe (WAT) și țesuturile adipoase maronii (BAT). Funcțiile majore ale WAT sunt încălzirea izolației, tamponarea pernei mecanice și, în cele din urmă, stocarea energiei. WAT acționează ca combustibil pentru dezechilibrele energetice atunci când energia de intrare este mai mică decât producerea de energie; prin urmare, WAT este considerat o componentă crucială în contribuția obezității [6]. BAT, pe de altă parte, accelerează cheltuielile de energie și combate în cele din urmă obezitatea [7, 8]. Exercițiul fizic este una dintre rutinele tipice de a pierde în greutate și de a remodela corpul grăbind rumenirea WAT ​​și stimulând oxidarea acizilor grași [9]. Nivelul ridicat de expresie a proteinei de decuplare mitocondrială 1 (UCP1) este un semn distinctiv al rumenirii WAT [9]. Mai mult, receptorul activat cu proliferatorul peroxizomului (PPARγ) și receptorul activat cu proliferatorul peroxizomului-coactivatorul gamma 1 (PGC1α) sunt doi factori transcripționali în modularea expresiilor genelor legate de adipogen, care sunt foarte exprimate în BAT [10]. Pe de altă parte, carnitina palmitoil transferaza I A (CPT1A) și genele lipazei sensibile la hormoni (HSL) pot spori activitățile mitocondriale și pot stimula oxidarea acizilor grași și, prin urmare, sunt clasificate drept semnătura oxidării acizilor grași [11].

Un amestec de plante vechi, scris de Chen Suan din dinastia Song (1155 d.Hr.) în „Chensuan Fuke Buji”, se știe că îmbunătățește „Qi” și „Blood”, denumite Danggui Buxue Tang (DBT1155). DBT1155 compune patru ierburi: Angelicae Sinensis Radix (ASR), Astragali Radix (AR), Jujuba Fructus (JF) și Zingiberis Rhizoma Recens (ZRR) într-un raport de greutate de 36: 30: 15: 20. Funcțiile antioxidante ale curcuminei ZRR îmbogățit au fost raportate pe scară largă, iar această formulă pe bază de plante sa dovedit a avea acumularea de antilipide în studiul nostru preliminar. Astfel, funcțiile antiobezității DBT1155 în adipocite 3T3-L1 cultivate au fost testate aici.

2. Materiale și metode

2.1. Pregătirea extractului de plante

Ierburile crude ale rădăcinii de Astragali membranaceus var. mongholicus (AR), rădăcină de Angelica sinensis (Măslin) Diels. (ASR), rod al Ziziphus jujuba CV. Jinsixiaozao (JF) și rizomul Zingiber officinale Roscoe (ZRR; ghimbir) au fost colectate și identificate în 2013. Specimenul de voucher de AR, ASR, JF și ZRR a fost păstrat în Centrul pentru Medicină Chineză din HKUST. AR, ASR, JF și ZRR într-un raport de greutate de 36: 30: 15: 20 au fost utilizate pentru a pregăti decoctul DBT1155. Amestecul a fost fiert în 8 volume de apă de două ori. Cincizeci de grame de ZRR au fost, de asemenea, fierte în apă de două ori, fiecare cu 8 volume de apă. Această pregătire a fost verificată în studiile anterioare [20, 21]. Toate probele au fost uscate prin liofilizare și resuspendate în apă la o concentrație finală de 100 mg/ml, care au fost menținute la -80 ° C.

2.2. Analiza HPLC și cuantificări chimice
2.3. Culturi celulare

Celulele fibroblaste de șoarece 3T3-L1 (CL-173) au fost obținute de la ATCC (Manassas, VA) și menținute la 37 ° C într-un incubator saturat cu apă conținând 5% CO2 și în DMEM suplimentat cu 4,5 g/L glucoză, 10% FBS, 100 U/ml penicilină și 100 μg/mL streptomicină. Inducerea diferențierii lipogene a fost detaliată într-un studiu anterior [24]. Pe scurt, celulele cultivate au fost tratate cu dexametazonă (1 μM, Sigma-Aldrich, St Louis, MO), insulină (1,8 μM, Sigma-Aldrich) și dibutril-cAMP (300 μM, Sigma-Aldrich) timp de 72 de ore pentru a induce lipogeneza. Culturile au fost stabilite ca ziua 0 și înlocuite cu mediul de cultură care conține insulină (1,8 μM) la fiecare două zile. În ziua 10, aproximativ 80% din culturi au fost induse să conțină trigliceride. Tratamente, inclusiv control negativ (doar 0,02% DMSO), cocktail (1,8 μM de rosiglitazonă și triiodotironină), concentrație scăzută de DBT (DBT-L, 0,125 mg/mL) și concentrație mare de DBT (DBT-H, 1,0 mg/mL) au fost date culturilor diferențiate (în ziua 10) timp de 72 de ore . Dacă nu se descrie altfel, toți reactivii de cultură au fost cumpărați de la Invitrogen Technologies (Waltham, MA).

2.4. Viabilitatea celulei

Viabilitatea celulară a fost măsurată prin testul MTT. Pe scurt, celulele au fost cultivate într-o placă cu 96 de godeuri. După tratamentele medicamentoase pentru duratele indicate, soluția MTT a fost adăugată în culturi în concentrația finală de 0,5 mg/ml; după incubare timp de 2 ore, producția de cristal purpuriu a fost dizolvată prin solvent DMSO. A fost măsurată absorbanța la 570 nm.

2.5. Ulei Roșu O colorare

Uleiul roșu O la 0,2% în izopropanol a fost filtrat. Celulele experimentale cultivate au fost spălate cu PBS, fixate cu paraformaldehidă (4% în PBS, Sigma-Aldrich) timp de 5 min, incubate cu colorare Oil Red O timp de 30 min și spălate de două ori cu PBS. Triglicerida colorată (TG) a fost rezolvată în izopropanol și măsurată la absorbția de 490 nm [24].

2.6. Microscopie cu fluorescență confocală laser

Măsurătorile fluorimetrice au fost efectuate pe celule 3T3 cultivate utilizând un sistem confocal de scanare laser Olympus Fluoview FV1000 (Olympus America, Manassas, VA) montat pe un microscop Olympus inversat, echipat cu un obiectiv 10X. Concentrația intracelulară de Ca 2+ a fost detectată de indicatorul fluorescent de calciu Fluo-4 AM (Sigma-Aldrich). Celulele cultivate au fost însămânțate pe lamele de acoperire din sticlă și incubate timp de 30 de minute la 37 ° C într-o soluție fiziologică normală conținând soluție fiziologică normală fără Ca2+ conținând 5 μM Fluo-4 AM. A23187 (Sigma-Aldrich), un ionofor de calciu, a fost folosit ca martor pozitiv. Cantitatea de Ca2+ a fost evaluată prin măsurarea intensității fluorescenței ieșind la 488 nm și emisă la 525 nm.

2.7. Analiza Western Blot

Expresiile proteice ale PPARγ, PGC1α, UCP1 și controlul intern GAPDH au fost dezvăluite prin western blot. Culturile au fost însămânțate pe o placă cu 6 godeuri. După tratamentul medicamentos timp de 72 de ore, inclusiv aplicarea inhibitorilor, culturile au fost recoltate în tampon de liză cu sare ridicată (1 M NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100), urmată de centrifugare la 16 100 rpm timp de 10 min la 4 ° C. Probele cu cantitate egală de proteină totală au fost adăugate cu tampon de liză 2X (0,125 M HCI, pH 6,8, 4% SDS, 20% glicerol, 2% 2-mercaptoetanol și 0,02% albastru de bromofenol) și încălzite la 95 ° C, iar proteina a fost supus analizei SDS-PAGE. După transfer, membranele au fost incubate cu anticorpi împotriva PPARγ, PGC1α, UCP1 și GAPDH (CST, Danvers, MA) la 1: 3.000 diluții la camera rece peste noapte.

Fosforilarea AMPK a fost, de asemenea, determinată prin testul Western blot. Culturile diferențiate au fost înfometate cu ser timp de 3 ore înainte de aplicarea medicamentului. După tratamentul cu BAMPTA-AM (10 μM) sau WZ4003 (100 nM; Selleck, München, Germania), culturile au fost colectate imediat în tampon de liză (125 mM Tris - HCI, 2% SDS, 10% glicerol, 200 mM 2-mercaptoetanol, pH 6,8). Proteina a fost supusă analizei SDS-PAGE. După transferarea proteinelor în membrane, membranele au fost incubate cu anti-fosfo-AMPK (Cell Signaling, MA) la diluție 1: 5.000 și anti-total-AMPK (Cell Signaling) la 1: 5.000 diluare la 4 ° C timp de 12 ore . După incubarea în anticorpi secundari anti-iepure conjugați cu peroxidază de hrean (HRP-) în diluare de 1: 5.000 timp de 3 ore la temperatura camerei, complexele imune au fost vizualizate prin metoda de chemiluminescență îmbunătățită (ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Intensitățile benzii din probele martor și stimulate de agoniști, rulate pe același gel și în condiții ECL strict standardizate, au fost comparate pe un analizor de imagine, utilizând în fiecare caz un grafic de calibrare construit dintr-un gel paralel cu diluții seriale ale uneia dintre probe.

2.8. Analiza RT-PCR

ARN-ul total a fost extras din celule adipocitare 3T3-L1 cu reactiv RNAzol (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. Probele de ARN cu raport OD260/OD280 mai mare de 2,0 au fost utilizate pentru PCR. unu μg de ARN total a fost utilizat pentru producerea de ADNc, utilizând un sistem PCR. Secvența de primer oligonucleotidic a fost după cum urmează: receptor activat de proliferator peroxizom (PPARγ): 5'-CCA GAG TCT GCT GAT CTG CG-3 'și 5'-GCC ACC TCT TTG CTC TGA TC-3'; receptor activat de proliferator peroxizom γ coactivator 1 (PGC1α): 5′-GAC CTG GAA ACT CGT CTC CA-3 și 5′-AAA CTT GCT AGC GGT CCT CA-3 ′; carnitina palmitoil transferază I A (CPT1A): 5'-GGA CAT TAT CAC CTT GTT TGG C-3 'și 5'-GGA GCA ACA CCT ATT CAT T-3'; lipază sensibilă la hormoni (HSL): 5'-GCG CTG GAG GAG TGT TTT T-3 'și 5'-CGC TCT CCA GTT GAA CCA AG-3'; proteina de decuplare mitocondrială 1 (UCP1): 5'-GAT GGT GAA CCC GAC AAC TT-3 'și 5'-CTG AAA CTC CGG CTG AGA AG-3'; 18S: 5′-GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3 ′ și 5′-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3 ′. Nivelurile de transcriere au fost cuantificate utilizând metoda valorii ΔCt, unde valorile genelor țintă au fost normalizate de 18S în același eșantion la început înainte de comparație. Produsele PCR au fost analizate prin electroforeză pe gel și analiza curbei de topire, pentru a confirma amplificarea specifică.

2.9. Analiza statistică și alte analize

Concentrațiile de proteine ​​au fost măsurate prin metoda lui Bradford (Herculues, CA). Testele statistice au fost făcute utilizând analiza unică a varianței. Datele au fost analizate prin testul t și exprimate ca medie ± SEM. Modificările semnificative statistic au fost clasificate ca semnificative (

) Unde p ) Unde p ) Unde p
(A)
(b)

Cromatograme tipice ale DBT1155 și extracte ZRR. Zece μL de 100 mg/mL de decoct DBT1155 (a) și 100 mg/mL de extract ZRR (b) au fost supuse analizei HPLC-DAD, iar amprentele chimice au fost descoperite la o lungime de undă de 254 nm. Identificarea acidului ferulic (A), a AMPc (B), a calicozinei (C), a formononetinei (D) și a 6-gingerolului (E) au fost marcate aici. Au fost prezentate cromatograme reprezentative, n = 3.

3.2. Funcțiile Browning WAT

Funcțiile DBT1155 și ZRR asupra acumulării lipidelor de adipocite 3T3-L1 cultivate au fost detectate de Oil Red O. Concentrația optimă de lucru a DBT a fost determinată prin testul MTT; cea mai mare concentrație de lucru a DBT1155 ar trebui să fie de 1 mg/ml, care a fost etichetat ca DBT-H. Cea mai mică concentrație ar trebui să fie 0,125 mg/ml, care a fost denumită DBT-L (Figura 1 suplimentară). Acumularea de lipide a fost redusă semnificativ sub aplicarea extractului DBT1155, care a fost într-o manieră dependentă de doză (Figurile 2 (a) și 2 (b)). Un mg/ml de decoct DBT (DBT-H) posedat

35% scade prin colorarea lipidelor în comparație cu martorul negativ (Figurile 2 (a) și 2 (b)). Efectul de acumulare antilipidă, declanșat de DBT1155, a fost mult mai puternic decât cel al ZRR singur (Figurile 2 (a) și 2 (b)). Rezultatele colorării lipidelor au implicat faptul că alți constituenți din DBT1155 ar putea potența activitatea de acumulare antilipidă a ZRR. IC50 al DBT1155 a fost

0,375 mg/ml. În același test, extractele din plante de AR, ASR și JF nu au prezentat un efect antilipid semnificativ (Figura 2 suplimentară). Aici, cocktailul a servit ca un control pozitiv, suprimând în mod dramatic acumularea de lipide

Scăderea cu 50%, comparativ cu un control negativ (Figurile 2 (a) și 2 (b)).

DBT1155 scade acumularea de lipide. Adipocitele 3T3-L1 au fost cultivate până la 10 zile de diferențiere și apoi aplicate cu cocktail (1,8 μM de rosiglitazonă și triiodotironină) sau concentrații diferite de DBT1155 (1 mg/mL de DBT etichetat ca DBT-H; 0,125 mg/mL de DBT etichetat ca DBT-L) sau ZRR (1 mg/mL de ZRR etichetat ca ZRR- H; 0,125 mg/ml de ZRR etichetat ca ZRR-L) pentru alte 3 zile. (a) Colorarea cu ulei roșu a fost de a măsura acumularea de lipide. Bară = 50 μm. (b) Cantitatea de lipide colorate a fost cuantificată la 490 nm absorbanță. Datele au fost exprimate ca medie ± SEM a procentului de modificare în comparație cu controlul, unde n = 3; p

Creșteți nivelurile de PPARγ, UCP1 și PCG1α sunt markerii de hală ai rumenirii WAT [25]. Într-adevăr, activările acestor gene au fost raportate la obezitate și/sau la bolile asociate acesteia [25]. Nivelurile de transcriere ale acestor gene specifice BAT au fost dezvăluite de RT-PCR din ARN total derivat din adipocite 3T3-L1 tratate cu DBT1155. Așa cum se arată în Figura 3, DBT1155 a crescut nivelurile de mRNA ale markerilor BAT într-o manieră dependentă de doză. Inducțiile maxime ale PPARγ, PCG1α, și UCP1 au fost dezvăluite la

De 3 ori, respectiv, sub aplicarea a 1 mg/ml de DBT1155. Mai mult, chelatorul de calciu, BAMPTA-AM, a fost utilizat aici pentru a identifica calea de semnalizare. Pre-tratarea acestui chelator în adipocite 3T3-L1 a suprimat dramatic transcripția genei specifice BAT (Figura 3). Nivelurile de expresie a proteinelor acestor markeri au fost, de asemenea, luate în considerare. Activitățile translaționale ale acestor gene specifice BAT, de exemplu, PPARγ la

58 kDa, PCG1α la

100 kDa și UCP1 la

30 kDa, au fost extrem de exprimate, de la 5 la 9 ori sub provocarea de 1 mg/ml de DBT1155 (Figura 4). Pe de altă parte, aplicarea BAMPTA-AM a abolit în mod semnificativ expresia crescută a proteinelor, declanșată de această formulă pe bază de plante antică (Figura 4). Luate împreună, decoctul DBT1155 poseda funcții antiobezitate prin accelerarea rumenirii WAT.


DBT1155 declanșează expresiile ARNm de rumenire ale markerilor WAT. Adipocitele 3T3-L1 au fost cultivate până la 10 zile de diferențiere. Apoi, culturile au fost aplicate cu cocktail sau diferite concentrații de DBT1155 (DBT-H: 1 mg/mL de DBT; DBT-L: 0,125 mg/mL) cu/fără cotratare a BAMPTA-AM (10 μM) pentru încă 3 zile. ARN-urile totale au fost izolate și reverstranscrise la ADNc pentru analiza PCR. Nivelurile de mARN ale PPARγ, PGC1α, și UCP1 au fost determinate prin metoda valorii Ct și normalizate de gena 18S rNAr care păstrează. Datele au fost exprimate ca medie ± SEM în comparație cu controlul, stabilind ca 1 aici, unde n = 3; p