Un model de organism pentru laboratoare de licență bazate pe anchetă

Faceți clic aici pentru a descărca Manualul (document PDF) sau navigați prin acest document HTML făcând clic pe titlurile Cuprinsului.

Cuprins

manual

Introducere

Informații generale

  • Istoria naturala
  • Ciclu de viață
  • Genetica
  • Dezvoltare

Cultură și metode de manipulare

  • Tehnici culturale
  • Timp de generație
  • Identificarea sexelor
  • Tehnici de manipulare
  • Măsurarea gândacilor
  • Împerecherea gândacilor
  • Izolarea Fecioarelor
  • Eliminarea culturilor

Citate din literatura

Introducere

Acest manual oferă informații de bază despre creșterea, manipularea și întreținerea culturilor de gândaci de fasole, Callosobruchus maculatus. Publicul nostru destinat este facultatea și personalul care predau sau coordonează cursuri de laborator universitare. Informațiile furnizate aici se bazează pe propriile experiențe de lucru cu această insectă la cursurile de laborator de licență și informații disponibile în literatura de cercetare. Referințele noastre la furnizori comerciali specifici pentru consumabile sunt destinate să vă ajute să găsiți tipurile de consumabile pe care le-am folosit, dar aceste referințe nu sunt o aprobare a acestor furnizori. Comentariile adresate autorilor cu corecții sau sugestii pentru informații suplimentare pentru a fi incluse în versiunile viitoare ale acestui manual ar fi mult apreciate.

Informații generale

Istoria naturala

Gândacii de fasole prezintă două forme adulte (morfuri), o formă sedentară (fără zbor) și o formă de dispersie (zburătoare). Morfa de dispersie este indusă de densitatea larvară ridicată în fasolea stocată sau în culturile de laborator și este cauzată de creșterea temperaturii micro-habitatului în funcție de densitate (Utida 1956, 1972,). Inducerea morfului de dispersie permite indivizilor să se mute în habitate noi, de calitate superioară. Aceste două morfe au caracteristici ale istoriei vieții foarte diferite, cum ar fi durata de viață mai lungă a adultului în morful de dispersie și fecunditatea redusă semnificativ în comparație cu morful sedentar (Utida 1956, 1972). În forma sedentară, sexele sunt extrem de dimorfe și se disting ușor, dar diferențele de sex sunt foarte subtile în forma de dispersie. Astfel, este esențial să se mențină culturile de laborator la densitate scăzută (una sau două larve pe fasole) și temperaturi nu mai mari de 30 ° C, dacă gândacii individuali trebuie identificați fără ambiguitate după sex (a se vedea Identificarea sexelor).

Suntem întrebați frecvent, de către studenți și chiar colegi universitari, care este scopul gândacilor de fasole? O durată de viață foarte scurtă a adulților și un stadiu larvar în care se produce hrănirea pe tot parcursul vieții sau nu este neobișnuit la insecte (de exemplu Ordinul Efemeropterele, mușchi), dar acest ciclu de viață pare ciudat în comparație cu dominanța etapelor adulte în familie. păsări și mamifere. În cele din urmă, în termeni evolutivi, scopul gândacilor de fasole este același ca în toate celelalte viețuitoare, se reproduc și lasă descendenți. Ecologic, gândacii de fasole sunt erbivori care s-au specializat pe consumul de semințe. Acestea fac parte din rețelele alimentare din acele ouă și larvele sunt prada speciilor de viespi parazitoide (Boeke și colab. 2003), iar adulții pot fi prada păsărilor, reptilelor și amfibienilor, astfel că au scopul de a furniza hrană altor organisme.

Callosobruchus maculatus are un cariotip de zece perechi de cromozomi (2N = 20) (Yadav 1971). Cromozomul 10 este un cromozom sexual, iar bărbații sunt sexul hetergametic (Figura 3). O trăsătură mendeliană a fost descrisă pentru gândacii de fasole, culoarea corpului care este autosomală și are alele cu dominanță incompletă (Eady 1991). Variația ereditară a mărimii corpului este bine descrisă (Fox și colab. 2004), la fel ca și istoria vieții și trăsăturile comportamentale, cum ar fi longevitatea și durata copulației (Brown și colab. 2009). Unele gene au fost izolate și caracterizate, de exemplu, gene cu reglarea transcrierii relevante pentru mediu (Chi et al. 2011). Baza de date de nucleotide din NCBI GenBank are mai mult de 175 de intrări pentru C. maculatus. Mai multe ansambluri transcriptom sunt disponibile prin GenBank și sunt disponibile pentru căutarea BLAST pe acest site web.

Dezvoltare

Fertilizarea are loc pe măsură ce femelele depun ouă și le lipesc pe suprafața unei semințe de fasole (Fabaceae). Dezvoltarea embrionară timpurie are loc în interiorul oului transparent până când prima larvă de instar (larvă) pătrunde prin învelișul semințelor în endospermul semințelor direct din ou. Dezvoltarea gândacilor de fasole este germen lung (Patel și colab. 1994) similară cu Drosophila în care determinarea segmentului corpului are loc la sfârșitul formării blastodermului. Coaja goală a oului este de obicei umplută cu frăsină albă (deșeuri fecale) pe măsură ce larva se hrănește (Figura 2a). Există patru instale larvare (Figura 4, Devereau și colab. 2003) care se hrănesc toate în interiorul endospermului semințelor pe care a fost depus oul. Puparea are loc în interiorul sămânței și un adult apare mestecând și îndepărtând o bucată circulară a stratului de semințe pentru a forma o gaură rotundă de ieșire (Figura 2f). Temperatura, speciile de fasole alese pentru depunerea ouălor și umiditatea relativă influențează timpul de dezvoltare și succesul (vezi Timpul generației).

Cultură și metode de manipulare

Tehnici culturale

Timp de generație

Timpul de generare depinde și de specia gazdă de fasole pe care alegi să o folosești. Am găsit timpuri mai lungi de generație în fasolea adzuki comparativ cu mazărea mung sau cea cu ochi negri. La 30 ° C, sunt necesare șapte săptămâni pentru apariția fasolei adzuki, comparativ cu 3-4 săptămâni din fasolea mung. Gândacii de fasole crescuți pe mazăre porumbel și fasole zambile au generații similare cu cele de pe fasolea adzuki.

Identificarea sexelor

Gândacii de fasole masculi și femele (de morf sedentar) se disting ușor unul de celălalt prin aspectul general. Cea mai distinctivă caracteristică este colorarea pe placa care acoperă capătul abdomenului. La femelă, placa este mărită și este de culoare închisă pe ambele părți (Figura 6). La mascul, placa este mai mică și nu are dungi. În general, femelele au dimensiuni mai mari decât masculii, dar există multe variații. La unele tulpini, femelele sunt de culoare neagră, iar masculii sunt maronii (Figura 6), dar la alții ambele sexe sunt maro.

Tehnici de manipulare

Deși gândacii de fasole morph sedentari sunt capabili să zboare, rareori o fac. Drept urmare, sunt ușor de manevrat. Gândacii pot fi mutați fie folosind perii de sortare Drosophila (Carolina Biological 17-3094; Ward’s Natural Science 470020-022), fie o pensulă moale (BioquipTM forceps grefă 4748 sau 4750; Ward’s Natural Science 470018-872).

Când îndepărtați gândacii din culturile de stoc, din vasele Petri individuale sau din farfurii pentru puțuri, atingeți ușor recipientele de pe banca de laborator înainte de a scoate capacul pentru a preveni accesarea imediată a gândacilor. Dacă capacul este lăsat mai mult de un minut sau cam așa, gândacii vor scăpa de bucatele de cultură.

Mai ales atunci când sunt păstrați individual, gândacii de fasole adesea „se joacă morți”. Nu vă lăsați păcăliți! O lovitură ușoară cu forceps sau perie le va face să se miște.

Măsurarea gândacilor

Masa corporală - Pentru a cântări gândacii individuali, este necesară o balanță analitică de 0,1 mg, cel puțin (de exemplu, Ohaus Analytical Balance Model PA84, Carolina Biological 702530, Fisher Scientific 02-112-298). Gândacii individuali pot fi așezați în fundul unui vas Petri de 35 mm (de exemplu, Falcon 351008, Fisher Scientific 08-757-100A sau vas de 60 mm, Carolina Biological 741246 sau Fisher Scientific 08-757-100B) pentru a fi cântărit.

Măsuri liniare - Măsurile liniare ale mărimii corpului, cum ar fi lungimea elitrelor (capacele aripilor dure), pot fi colectate cu ușurință la adulții morți. Astfel de măsurători pot fi facilitate utilizând o cameră video la microscop ieftină, cum ar fi Moticam 1 (Carolina Biological 591405) atașată la ocularul unui microscop de disecție. Această cameră video se conectează direct la un computer (computer Mac sau Windows) prin portul USB, iar măsurătorile se fac utilizând software-ul de analiză a imaginii (inclus cu camera) pentru a evalua lungimea unei linii trasate pe o parte a corpului într-o imagine capturată sau într-o imagine video live. Animalele moarte pot fi sortate după sex și lipite pe fișiere pentru măsurare la microscopul de disecție. Un program gratuit de analiză a imaginii (NIH Image J) poate fi utilizat pentru a efectua măsurători pe orice imagine digitală, inclusiv pe cele capturate cu o cameră Motic.

Împerecherea gândacilor

Atât gândacii virgini, cât și cei non-virgini se vor împerechea cu ușurință. Cu toate acestea, masculii virgini nu pot produce spermatofori complet formați decât după 24 de ore de la apariție. În plus, femelele pot să nu se împerecheze câteva ore după o împerechere anterioară.

Pentru a împerechea gândacii, așezați gândacii într-un vas Petri de 35 mm (de exemplu, Falcon 351008, Fisher Scientific 08-757-100A sau vas de 60 mm, Carolina Biological 741246 sau Fisher Scientific 08-757-100B). Bărbații vor urmări femelele până când vor putea să se monteze și să copuleze cu femelele (Figura 7). Copulația începe în general în decurs de 10-15 minute, dar uneori poate să nu înceapă timp de 30 de minute până la o oră.

Pentru a determina dacă un mascul a transferat cu succes un spermatofor în timpul copulării, cântăriți masculul înainte și copulația. Bărbații pot pierde până la 5% sau mai mult din masa corporală din cauza transferului de spermatofori. Cu toate acestea, dimensiunea spermatoforilor va scădea odată cu împerecherea ulterioară de către un anumit mascul.

Izolarea Fecioarelor

Pentru a izola gândacii virgini, așezați o femelă împerecheată într-un vas Petri de 35 mm (de exemplu, Falcon 351008, Fisher Scientific 08-757-100A sau vas de 60 mm, Carolina Biological 741246 sau Fisher Scientific 08-757-100B) cu un singur strat de fasole . Marea majoritate a femelelor dintr-o cultură de animale se vor împerechea și sunt capabile să depună ouă fertile. După 12-24 de ore, femelele vor începe să depună ouă pe fasole. Cu excesul de fasole, femelele vor depune un singur ou pe fiecare fasole. Găsirea ouălor pe fasole poate fi facilitată folosind un microscop de disecție (la o mărire totală de 10x) sau o lupă mare (lupă de 2,5x Fisher Scientific 14-648-19 sau VWR 62379-535). Îndepărtați fasolea cu ouă unice (Figura 8) și așezați fiecare bob într-o cutie Petri individuală de 35 mm sau în puțul unei plăci de sonde de cultură de țesut netratate cu 6 sau 12 godeuri (plăci de cultură de țesut Falcon, Fisher Scientific). Umpleți din nou fasolea pe măsură ce sunt îndepărtate. O singură femelă poate produce peste 100 de ouă în timpul vieții. În general, raportul de sex este 1: 1.

Eliminarea culturilor

Gândacii de fasole sunt o posibilă insectă agricolă dăunătoare care nu este distribuită în Statele Unite și Canada. Această specie este absentă în mare parte din America de Nord, deoarece este intolerantă la temperaturi de îngheț și speciile de plante gazdă adecvate nu se numără printre florile noastre native (non-agricole). Cu toate acestea, este prudent și adecvat să eliminați adulții vii și fasolea care au avut contact cu adulții vii, într-un mod care să împiedice eliberarea lor în mediul natural. Plasarea unei culturi vii (sau a oricăror boabe expuse la gândaci adulți) într-un congelator (0 ° C) timp de minimum 72 de ore înainte de eliminare va asigura că gândacii la fiecare etapă a ciclului de viață sunt morți. Apoi, aruncați cultura congelată în același mod ca și risipa de alimente.

Citate din literatura

Bisby, F.A., J. Buckingham și J.B. Harborne (editori). 1994. Dicționar fitochimic al leguminozelor. Volumul 1. Plantele și constituenții lor. Chapman și Hall, Londra. 1180 pagini.

Boeke, S.J., A.A.C. Sinzogan, R.P. de Almeida, P.W.M. de Boer, G. Jeong, D.K. Kossou și J.J.A. van Loon. 2003. Efectele secundare ale tratamentului cu găolină cu insecticide botanice asupra a doi parazitoizi ai Callosobruchus maculatus. Entomologia Experimentalis et Applicata 108: 43–51.

Brown, E.A., L. Gay, R. Vasudev, T. Tregenza, P.E. Eady și D.J. Hosken. 2009. Asocieri fenotipice și genetice negative între durata copulației și longevitatea la gândacii de semințe masculi. Heredity (2009) 103, 340-345.

Brown, L. și J.F. Downhower. 1988. Analize in Behavioral Ecology: A Manual for Lab and Field. Sinauer Associates, str. 194.

Chi, Y.H., J.-E. Ahn, D.-J. Yun, S.Y. Lee, T.-X. Liu și K. Zhu-Salzman. 2011. Modificările din mediul de oxigen și dioxid de carbon modifică expresia genică a brușidelor de cowpea. Journal of Insect Physiology 57: 220-230.

Devereau, A.D., I. Gudrups, J.H. Appleby și P.F. Credland. 2003. Screening automat, rapid al rezistenței semințelor la cowpea, Vigna unguiculata (L.) Walpers, la gândacul semințelor Callosobruchus maculatus (F.) (Coleoptera: Bruchidae) utilizând monitorizarea acustică. Journal of Stored Products Research 39: 117-129.

Eady, P.E. 1991. Concurența spermatozoizilor în Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchedae): o comparație a două metode utilizate pentru estimarea paternității. Entologie ecologică 16: 45-53.

EOL. 2011. Callosobruchus maculatus (Fabricius, 1775) ”. Enciclopedia vieții. http://www.eol.org/pages/1172676 Accesat la 20 martie 2011.

Fox, C.W., M.L. Bush, D.A. Roff și W.G. Wallin. 2004. Genetica evolutivă a duratei de viață și a ratelor de mortalitate la două populații de gândaci de semințe, Callosobruchus maculatus. Ereditatea 92: 170-181.

Howe, R.W. și J.E. Currie. 1964. Câteva observații de laborator asupra ratelor de dezvoltare, mortalitate și ovipoziție a mai multor specii de Bruchidae care se reproduc în impulsuri stocate. Buletinul cercetărilor entomologice. 55: 437-477.

ESTE. 2011. Bruchinae (Latreille, 1802). Sistem integrat de informații taxonomice. http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=678800 Raport ITIS accesat 20 martie 2011.

Janzen, D.H. 1977. Cum mor larvele de gărgăriță sudică (Bruchidae Callosobruchus maculatus) pe semințe care nu sunt gazde. Ecologie 58: 921-927.

Janzen, D.H., H.B. Juster și I.E. Liener. 1976. Acțiunea insecticidă a fitohemaglutininei în fasole neagră pe un gândac bruchid. Știință 192: 795-
796.

Kergoat, G.J., J.-F. Silvain, A. Delobel, M. Tuda, K.-W. Anton. 2007. Definirea limitelor conservatorismului taxonomic în utilizarea gazdei - plante pentru insectele fitofage: sistematică moleculară și evoluția asociațiilor gazdă - plantă din genul Bruchus Linnaeus (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae). Molecular Phylogenetics and Evolution 43 (2007): 251-269.

Patel, N.H., B.G. Condron și K. Zinn. 1994. Modelele de exprimare a regulilor de perechi ale saltului egal se găsesc atât în ​​gândacii cu germeni scurți, cât și în cei lungi. Natura 367: 429-434.

Schoof, H.F. 1941. Efectele diferitelor umidități relative asupra proceselor de viață ale gărgăriței de cowpea din sud, Callosobruchus maculatus (Fabr.) La 30 C., +/- 0,8 grade. Ecologie 22 (3): 297-305.

Tuda, M., J. Rönn, S. Buranapanichpan, N. Wasano și G. Arnqvist. 2006, Diversificarea evolutivă a genului Callosobruchus (Coleoptera: Bruchidae): trăsături asociate cu starea dăunătorului produsului stocat. Ecologie moleculară 15: 3541–3551.

Serviciul de cercetare agricolă USDA, Laboratorul de date despre nutrienți. USDA National Nutrient Database for Standard Reference.http: //www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/search/ Accesat la 25 iunie 2009.

Utida, S. 1956. Dimorfismul de „fază” observat la populația de laborator a gărgăriței cowpea, Callosobruchus quadrimaculatus. Al 2-lea raport. Efectele diferențiale ale temperaturii, umidității și densității populației asupra unor caractere ecologice ale celor două faze. Cercetări privind ecologia populației 3: 93-104 (în japoneză, rezumat în engleză).

Utida, S. 1972. Polimorfismul dependent de densitate la adultul Callosobruchus maculatus (Coleoptera, Bruchidae). Journal of Stored Products Research 8: 111-126.